Оценка безопасности применения фемтосекундного лазера для выкраивания лимбальных трансплантатов роговицы

Цель: в эксперименте in vitro изучить выживаемость и сохранность пролиферативной активности лимбальных стволовых клеток (ЛСК) в фрагментах ткани лимба, выкроенных фемтосекундным лазером (ФСЛ).

Материалы и методы. Из донорских кадаверных глаз (n = 8) в верхней и нижней частях лимба, содержащих наибольшее количество лимбальных стволовых клеток, фемтосекундным лазером модели Z8 (Ziemer, Швейцария) формировали лимбальные фрагменты, которые фрагментировали на 4 мини-трансплантата с применением разных уровней энергии (100, 110, 120%). Контролем служили мини-трансплантаты из симметричных участков кадаверных глаз, которые выделяли мануально при помощи микрохирургического лезвия. Культивирование мини-трансплантатов проводили на протяжении двух недель в культуральных средах, предназначенных для лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК) (Epilife (0,06 мМ Ca⁺⁺) и для мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) (DMEM/F12) с добавлением специфических факторов роста с целью избирательного стимулирования ЛЭСК или ММСК соответственно. Фенотип полученных культивированных клеток в группах «лазер» и «нож» определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора маркеров к мембранным белкам ЛЭСК и ММСК: CD166, CD105, CD90, CD29, CD34. Способность культивированных клеток к адгезии и пролиферации в группах «лазер» и «нож» определяли путем посева третьего пассажа полученных культур на Боуменову мембрану бесклеточных роговиц.

Результаты. Первичную культуру клеток получили из мини-трансплантатов всех доноров в обеих группах. Морфология клеток соответствовала фенотипу эпителиальных клеток роговицы (паттерн по типу «булыжной мостовой»). При культивировании в среде EpiLife (0,06 мМ Ca⁺⁺) определили наличие пролиферации ЛСК из 38,6% мини-трансплантатов, в среде DMEM/F12 (1 : 1) – из 31,8%. Через две недели выход клеток из мини-трансплантатов в группах «лазер» и «нож» составил 77,2 и 63,6% соответственно. Рост клеток к концу второй недели культивирования мини-трансплантатов, полученных ФСЛ на энергиях 120, 110 и 100%, составил соответственно 87,5; 71,4 и 71,4%. Было установлено, что полученные культуры клеток в группах «лазер» и «нож» и подгруппах «120%», «110%» и «100%» фенотипически не отличались. Анализ методом цитофлуориметрии показал, что культуры клеток в группах имели смешанный паттерн экспрессии маркеров как ЛЭСК (CD29+), так и ММСК (CD90+, CD105+). Посев третьего пассажа культуры клеток в исследуемых группах во всех случаях продемонстрировал адгезию и формирование на Боуменовой мембране модельных роговиц монослоя клеток.

Заключение. Применение ФСЛ для выкраивания лимбальных трансплантатов представляется нам эффективным и безопасным по сравнению с традиционной механической (ножевой) методикой. Культуры клеток, полученные из мини-трансплантатов, выкроенных ФСЛ, были способны к росту и миграции на протяжении как минимум 21 суток.

1. Thoft RA, Friend J. the X,Y,Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Invest Opthalmolo Vis Sci 1983; 24:1442-43.

2. Del Monte DW, Kim T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg 2011; 37:588–98.

3. Parfitt GJ, Kavianpour B, Wu KL, Xie Y, Brown DJ, Jester JV. Immunofluorescence tomography of mouse ocular surface epithelial stem cells and their niche microenvironment. Investig Ophthalmol Vis Sci 2015; 56:7338–44.

4. Grieve K, Ghoubay D, Georgeon C, Thouvenin O, Bouheraoua N, Paques M, et al. Three-dimensional structure of the mammalian limbal stem cell niche. Exp Eye Res 2015; 140:75–84.

5. Ramirez BE, Victoria DA, Murillo GM, Herreras JM, Calonge M. In vivo confocal microscopy assessment of the corneoscleral limbal stem cell niche before and after biopsy for cultivated limbal epithelial transplantation to restore corneal epithelium. Histol Histopathol 2015; 30:183–92.

6. Massie I, Dziasko M, Kureshi A, Levis HJ, Morgan L, Neale M, et al. Advanced imaging and tissue engineering of the human limbal epithelial stem cell niche. Methods Mol Biol 2015; 1235:179–202.

7. Nubile M, Curcio C, Dua HS, Calienno R, Lanzini M, Iezzi M, et al. Pathological changes of the anatomical structure and markers of the limbal stem cell niche due to inflammation. Mol Vis 2013; 19:516–25.

8. Notara M, Shortt AJ, O'Callaghan AR, Daniels JT. The impact of age on the physical and cellular properties of the human limbal stem cell niche. Age 2013; 35:289–300.

9. Notara M, Refaian N, Braun G, Steven P, Bock F, Cursiefen C. Short-term uvbirradiation leads to putative limbal stem cell damage and niche cell-mediated upregulation of macrophage recruiting cytokines. Stem Cell Res 2015; 15:643–54.

10. Kim BY, Riaz KM, Bakhtiari P, Chan CC, Welder JD, Holland EJ, et al. Medically reversible limbal stem cell disease: clinical features and management strategies. Ophthalmology 2014; 121:2053–8.

11. Deng SX, Borderie V, Chan CC, Dana R, Figueiredo FC, Gomes JAP et al. Global Consensus on Definition, Classification, Diagnosis, and Staging of Limbal Stem Cell Deficiency. Cornea. 2019; 38(3): 364-375.

12. Малюгин Б.Э., Герасимов М.Ю., Борзенок С.А., Головин А.В. Клеточная хирургия при дисфункции стволовых клеток лимба. Офтальмохирургия. 2019;(1):77-86. https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-77-86

13. Sangwan VS, Basu S, MacNeil S, et al. Simple limbal epithelial transplantation (SLET): a novel surgical technique for the treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol. 2012;96: 931–934

14. Basu S, Sureka SP, Shanbhag SS, et al. Simple limbal epithelial transplantation: long-term clinical outcomes in 125 cases of unilateral chronic ocular surface burns. Ophthalmology. 2016;123: 1000–1010

15. Malyugin B.E., Gerasimov M.Y., Borzenok S.A. Glueless simple limbal epithelial transplantation. The report of the first two cases// CORNEA. 2020;39 (12):1588–1591. DOI: 10.1097/ICO.0000000000002467

16. Борзенок С.А., Герасимов М.Ю., Комах Ю.А., Хубецова М.Х., Тонаева Х.Д., Маликова Л.М., Плакса П.И. Алгоритм инфекционного скрининга доноров роговиц в Глазном тканевом банке ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Офтальмохирургия.2022;

17. Малюгин Б.Э., Борзенок С.А., Герасимов М.Ю. Клинические результаты трансплантации аутологичного культивированного эпителия полости рта при дисфункции стволовых клеток лимба роговицы. Офтальмохирургия. 2020;(4):77-85. [In Russ, English abstract] https://doi.org/10.25276/0235-4160-2020-4-77-85.

18. Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Герасимов М.Ю., Островский Д.С. Методические основы трансплантации аутологичного культивированного эпителия полости рта. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2021;23(1):171-177. [In Russ, English abstract] https://doi.org/10.15825/1995-1191-2021-1-171-177.

19. Gerasimov MY, Ostrovskiy DS, Shatskikh AV, Borzenok SA, Malyugin BE. Labial mucosal epithelium grafting in an ex vivo human donor cornea model. Exp Eye Res. 2022;216:108931. doi:10.1016/j.exer.2022.108931.

20. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019

21. Andjelic S, Lumi X, Vereb Z, Josifovska N, Facsko A, Hawlina M, et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of immunology research. 2014;2014:232659. doi:10.1155/2014/232659.

22. Szabó DJ, Noer A, Nagymihály R, et al. Long-Term Cultures of Human Cornea Limbal Explants Form 3D Structures Ex Vivo - Implications for Tissue Engineering and Clinical Applications. PLoS One. 2015;10(11):e0143053. doi:10.1371/journal.pone.0143053.

23. Yamanda K,Young RD, Lewis PN,Shinomiya K, Meek KM, Kinoshita S, et al. Mesenchymal- epithelial cell interactions and proteoglycan matrix composition in presumptive stem cell niche of the rabbit corneal limbus. Mol Vis 2015; 21: 1328-39

24. Dziasko MA, Armer HE, Levis HJ, Shortt AJ, Tuft S, Daniels JT. Localisation of epithelial cells capable of holoclone formation in vitro and direct interaction with stromal cells in the native human limbal crypt. PLoS One 2014;9:e94283

25. Mathews S, Chidambaram JD, Lanjewar S, Mascarenhas J, Pranja NV, Muthukkaruppan V. et al. In vivo confocal microscope analysis of normal human anterior limbal stroma. Cornea 2015;34:464-70

26. Higa K, Kato N, Yoshida S, Ogawa Y, Shimazaki J, Tsubota K, et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-caderin-positive clustersin the basal limbal epithelium. Stem Cell Res 2013;10:147-55.

27. Xie HT, Chen SY, Li GG, Tseng SC. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cell 2011;29:1874-85.

28. Han B, Chen SY, Zhu YT, Tseng SC. Integration of BMP/Wnt signaling to control clonal growth of limbal epithelial progenitor cells by niche cells. Ctem Cell Res 2014;12:562-73.

29. Notara M, Shrott AJ, Galatowicz G, Calder V, Daniels JT. IL6 and the human limbal stem cell niche: a mediator of epithelial-stromal interaction. Stem Cell Res 2010;5:188-200.

30. Polisetti N, Agarwal P, Khan I, Kondaiah P, Sangwan VS, Vemuganti GK. Gene expression profile of epithelial cells and mesenchymal cells derived from limbal explant culture. Mol Vis 2010;16:1227-40.

31. Choi S, Kim J, Lee D. A New Surgical Technique: A Femtosecond Laser-Assisted Keratolimbal Allograft Procedure. Cornea 2010; 29:924–929.

32. Riau AK, Liu Y-C, Lwin NC, et al. Comparative study of nJ- and µJ-energy level femtosecond lasers: evaluation of flap adhesion strength, stromal bed quality, and tissue responses. Invest Ophthalmol Vis Sci.2014; 55:3186–3194. DOI:10.1167/iovs.14-14434.