Трехмерный анализ микро- и наноструктуры биоматериалов и клеток методом сканирующей зондовой крионанотомографии

Цель. Провести трехмерный анализ микро- и наноструктуры и количественных морфологических параметров альгинатных сферических клеточных микроносителей и макроносителей на основе регенерированного шелка, модифицированных микрочастицами межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы, а также клеток гепатокарциномы человека HepG2, адгезированных на микро- и макроносители.

Материалы и методы. Трехмерные пористые матриксы из регенерированного шелка, полученные методом выщелачивания, и сферические альгинатные микроносители, полученные методом инкапсуляции, были витализированы клетками гепатокарциномы человека HepG2. Изучение трехмерной структуры клеток и микро- и макроносителей производилось при температуре –120 °С методом сканирующей зондовой крионанотомографии при помощи экспериментальной установки, объединяющей криоультрамикротом и сканирующий зондовый микроскоп.

Результаты. Получены трехмерные нанотомографические реконструкции клеток HepG2, адгезированных на стенку макропоры матрикса из регенерированного шелка и на сферический альгинатный микроноситель. Определены морфологические параметры поверхностей макро- и микроносителей и адгезированных клеток: средняя шероховатость, удельная эффективная площадь и длина автокорреляции. Установлено, что средняя шероховатость поверхности альгинатных микроносителей составляет 76,4 ± 7,5 нм, а средняя шероховатость поверхности стенки макроносителя на основе регенерированного шелка – 133,8 ± 16,2 нм, в то время как средняя шероховатость внешних поверхностей клеток, адгезированных на микро- и макроносители, составляет 118,5 ± 9,0 и 158,8 ± 21,6 нм соответственно. Получены трехмерные реконструкции внутриклеточных компартментов размером от 140 до 500 нм.

Выводы. Полученные в результате исследования количественные характеристики морфологии поверхностей клеточных носителей и адгезированных на них клеток позволяют исследовать корреляцию морфологических параметров поверхностей клеточных носителей и их биологические свойства. Использование метода сканирующей зондовой крионанотомографии для трехмерного анализа структуры и характеристик биоматериалов, клеток и биоискусственных клеточных конструкций позволит повысить эффективность разработок по созданию новых клеточно-инженерных конструкций с заданными физико-химическими и биологическими характеристиками для задач тканевой инженерии и регенеративной медицины. 

1. Zankel A, Wagner J, Poelt P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 2014; 62: 66–78. DOI: 10.1016/j.micron.2014.03.002.

2. Alekseev A, Efi mov A, Loos J, Matsko N, Syurik J. Threedimensional imaging of polymer materials by Scanning Probe Tomography. Eur. Polym. J. 2014; 52: 154–165. DOI: 10.1016/j.eurpolymj.2014.01.003.

3. Ho ST, Hutmacher DW. A comparison of micro CT with other techniques used in the characterization of scaffolds. Biomaterials. 2006; 27 (8): 1362–1376. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2005.08.035.

4. Bradley RS, Robinson IK, Yusuf M. 3D X-Ray Nanotomography of Cells Grown on Electrospun Scaffolds. Macromol. Biosci. 2017; 17: 1600236. DOI: 10.1002/ mabi.201600236.

5. Langer M, Peyrin F. 3D X-ray ultra-microscopy of bone tissue. Osteoporosis Int. 2016; 27: 441–455. DOI: 10.1007/s00198-015-3257-0.

6. Bailey RJ, Geurts R, Stokes DJ, de Jong F, Barber AH. Evaluating focused ion beam induced damage in soft materials. Micron. 2013; 50: 51–56. DOI: 10.1016/j.micron.2013.04.005.

7. Linkov P, Artemyev M, Efi mov AE, Nabiev I. Comparative advantages and limitations of the basic metrology methods applied to the characterization of nanomaterials. Nanoscale. 2013; 5: 8781–8798. DOI: 10.1039/c3nr02372a.

8. Caplan J, Niethammer M, Taylor II RM, Czymmek KJ. The Power of Correlative Microscopy: Multi-Modal, MultiScale, Multi-Dimensional. Curr. Opin. Struct. Biol. 2011; 21: 686–693. DOI: 10.1016/j.sbi.2011.06.010.

9. Binnig G, Quate CF, Gerber C. Atomic force microscope. Phys. Rev. Lett. 1986; 56 (9): 930–933. DOI: 10.1103/PhysRevLett.56.930.

10. Magonov SN, Reneker DH. Characterization of polymer surfaces with atomic force microscopy. Annu. Rev. Mater. Sci. 1997; 27 (1): 175–222. DOI: 10.1146/annurev. matsci.27.1.175

11. Gallyamov MO. Scanning Force Microscopy as Applied to Conformational Studies in Macromolecular Research. Macromol. Rapid Commun. 2011; 32 (16): 1210–1246. DOI: 10.1002/marc.201100150.

12. Alekseev A, Loos J, Koetse MM. Nanoscale electrical characterization of semiconducting polymer blends by conductive atomic force microscopy (C-AFM). Ultramicroscopy. 2006; 106 (3): 191–199. DOI: 10.1016/j.ultramic.2005.07.003.

13. Zhang L, Sakai T, Sakuma N, Ono T, Nakayama K. Nanostructural conductivity and surface-potential study of low-fi eld-emission carbon fi lms with conductive scanning probe microscopy. Appl. Phys. Lett. 1999; 75: 3527–3529. DOI: 10.1063/1.125377.

14. Hartmann U. Magnetic force microscopy: Some remarks from the micromagnetic point of view. J. Appl. Phys. 1988; 64 (3): 1561–1564. DOI: 10.1063/1.341836

15. Noy A, Vezenov DV, Lieber CM. Chemical Force Microscopy. Annu. Rev. Mater. Sci. 1997; 27: 381–421. DOI: 10.1146/annurev.matsci.27.1.381.

16. Zlatanova J, Lindsay SM, Leuba SH. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2000; 74 (1–2): 37–61. DOI: 10.1016/S0079-6107(00)00014-6.

17. Efi mov AE, Tonevitsky AG, Dittrich M, Matsko NB. Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: a novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy. 2007; 226 (3): 207–217. DOI: 10.1111/j.13652818.2007.01773.x.

18. Efi mov AE, Gnaegi H, Schaller R, Grogger W, Hofer F, and Matsko NB. Analysis of native structure of soft materials by cryo scanning probe tomography. Soft. Matter. 2012; 8: 9756–9760. doi:10.1039/c2sm26050f.

19. Hunt A, Ewing R. Percolation Theory for Flow in Porous Media, Lect. Notes Phys. Springer: Berlin Heidelberg, 2009: 771.

20. Efi mov AE, Moisenovich MM, Bogush VG, Agapov II. 3D nanostructural analysis of silk fi broin and recombinant spidroin 1 scaffolds by scanning probe nanotomography. RSC Adv. 2014; 4: 60943–60947. DOI: 10.1039/c4ra08341e.

21. Efi mov AE, Agapova OI, Parfenov VA, Pereira FDAS, Bulanova EA, Mironov VA, Agapov II. Investigating the Micro- and Nanostructure of Microfi brous Bioсompatible Polyurethane Scaffold by Scanning Probe Nanotomography. Nanotechnol. Russ. 2015; 10 (11–12): 925–929. DOI: 10.1134/S1995078015060038.

22. Thiele S, Vierrath S, Klingele M, Zengerle R. Tomographic Analysis of Polymer Electrolyte Fuel Cell Catalyst Layers: Methods, Validity and Challenges. ECS Trans. 2015; 69 (17): 409–418. DOI 10.1149/06917.0409ecst.

23. Alekseev A, Efi mov A, Lu K, Loos J. Three-dimensional electrical property reconstruction of conductive nanocomposites with nanometer resolution. Advanced Materials. 2009; 21 (48): 4915–4919. DOI: 10.1002/ adma.200901754.

24. Alekseev A, Chen D, Tkalya EE, Ghislandi MG, Syurik Y, Ageev O et al. Local Organization of Graphene Network Inside Graphene/Polymer Composites. Adv. Funct. Mater. 2012; 22 (6): 1311–1318. DOI: 10.1002/ adfm.201101796.

25. Mochalov KE, Efi mov AE, Bobrovsky A, Agapov II, Chistyakov AA, Oleinikov VA et al. Combined Scanning Probe Nanotomography and Optical Microspectroscopy: A Correlative Technique for 3D Characterization of Nanomaterials. ACS Nano. 2013; 7 (10): 8953–8962. doi: 10.1021/nn403448p.

26. Brazhnik K, Sokolova Z, Baryshnikova M, Bilan R, Efi mov A, Nabiev I, Sukhanova A. Quantum dot-based lab-on-a-bead system for multiplexed detection of free and total prostate-specifi c antigens in clinical human serum samples. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2015; 11: 1065–1075. DOI: 10.1016/j.nano.2015.03.003.

27. Bilan RS, Krivenkov VA, Berestovoy MA, Efi mov AE, Agapov II, Samokhvalov PS et al. Engineering of Optically Encoded Microbeads with FRET-Free Spatially Separated Quantum-Dot Layers for Multiplexed Assays. ChemPhysChem. 2017; 18 (8): 970–979. DOI: 10.1002/cphc.201601274.

28. Efi mov AE, Agapova OI, Agapov II. Scanning Probe Nanotomograph: Features of Engineering Solutions for Low-Temperature Analysis of Biomedical Materials. Biomed. Eng. 2015; 49: 132–135. DOI: 10.1007/s10527015-9514-x.

29. Efi mov AE, Agapova OI, Safonova LA., Bobrova MM, Volkov AD, Khamkhash L, Agapov II. Cryo scanning probe nanotomography study of the structure of alginate microcarriers. RSC Adv. 2017; 7: 8808–8815. DOI: 10.1039/c6ra26516b.

30. Сургученко ВА, Пономарева АС, Ефимов АЕ, Немец ЕА, Агапов ИИ, Севастьянов ВИ. Особенности адгезии и пролиферации фибробластов мыши линии NIH/ЗТЗ на пленках из бактериального сополимера поли (3-гидроксибутират-CO-3-гидроксивалерата) с различной шероховатостью поверхности. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012; 14 (1): 72–77. DOI:10.15825/1995-1191-2012-1-72-77. Surguchenko VA, Ponomareva AS, Efi mov AE, Nemec EA, Agapov II, Sevast’yanov VI. Osobennosti adgezii i proliferacii fi broblastov myshi linii NIH/ZTZ na plenkah iz bakterial’nogo sopolimera poli (3-gidroksibutirat-CO-3-gidroksivalerata) s razlichnoj sherohovatost’yu poverhnosti. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. 2012; 14 (1): 72–77. DOI:10.15825/1995-1191-2012-1-72-77.

31. Vasilets VN, Surguchenko VA, Ponomareva AS, Nemetz EA, Sevastianov VI, Jin Woo Bae JW, Park KD. Effects of surface properties of bacterial poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) on adhesion and proliferation of mouse fi broblasts. Macromol. Res. 2015; 23: 205–213. DOI: 10.1007/s13233-015-3025-1

32. Nikkhah M, Edalat F, Manoucheri S, Khademhosseini A. Engineering microscale topographies to control the cellsubstrate interface. Biomaterials. 2012; 33: 5230–5246. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2012.03.079.

33. Dvir T, Timko BP, Kohane DS, Langer R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 2011; 6: 13–22. DOI: 10.1038/nnano.2010.246.

34. Агапова ОИ, Ефимов АЕ, Мойсенович ММ, Богуш ВГ, Агапов ИИ. Сравнительный анализ трехмерной наноструктуры пористых биодеградируемых матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка для регенеративной медицины. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2015; 17 (2): 37–44. DOI:10.15825/1995-1191-2015-2-37-44. Agapova OI, Efi mov AE, Mojsenovich MM, Bogush VG, Agapov II. Sravnitel’nyj analiz trekhmernoj nanostruktury poristyh biodegradiruemyh matriksov iz rekombinantnogo spidroina i fi broina shelka dlya regenerativnoj mediciny. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. 2015; 17 (2): 37–44. DOI:10.15825/1995-1191-2015-2-37-44.

35. Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, Izamis ML, Guzzardi MA, Shulman C et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 2010; 16 (7): 814–820. DOI: 10.1038/nm.2170.

36. Онищенко НА, Крашенинников МЕ, Шагидулин МЮ, Боброва ММ, Севастьянов ВИ, Готье СВ. Гепатоспецифический мелкодисперсный матрикс как важный компонент имплантируемых клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени. Гены и клетки. 2016; 11 (1): 54–60. Onishchenko NA, Krasheninnikov ME, Shagidulin MYu, Bobrova MM, Sevast’yanov VI, Got’e SV. Gepatospecifi cheskij melkodispersnyj matriks kak vazhnyj komponent implantiruemyh kletochno-inzhenernyh konstrukcij vspomogatel’noj pecheni. Geny i kletki. 2016; 11 (1): 54–60.

37. Glancy B, Hartnell LM, Malide D, Yu Z-X, Combs CA, Connelly PS et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 2015; 523: 617– 620. DOI: 10.1038/nature14614.

38. Sulkin MS, Yang F, Holzem KM, Van Leer B, Bugge C, Laughner JI et al. Nanoscale three-dimensional imaging of the human myocyte. J. Struct. Biol. 2014; 188 (1): 55–60. DOI: 10.1016/j.jsb.2014.08.005.