Клеточная нейропротекция как современный подход к лечению оптических нейропатий

Цель. Разработать технологию создания 3D-сфероидов мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба кадаверных глаз человека, способных к длительной и достаточной секреции фактора роста нервов и нейротрофического фактора головного мозга.

Материал и методы. Из кадаверных глаз человека (n = 8) выделялась зона лимба, содержащая наибольшее количество ММСК. Культивирование проводилось в среде: DMEM/F12 (1:1), L-глутамин, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, HEPES, инсулин, дексаметазон, 10 об. % FBS при стандартных условиях (5% СО2, 37 °C), смена среды проводилась каждые 3 дня. Фенотип полученной культуры клеток изучали методом иммунофенотипирования с использованием набора маркеров к мембранным белкам (CD73, CD105, CD19, CD90, CD133). Стимуляцию секреции нейротрофических факторов проводили по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации. 3D-клеточные сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США) для трех групп сравнения: I группа – контрольная, сфероиды из интактной 2D-культуры ММСК; II группа – сфероиды из индуцированной 2D-культуры ММСК; III группа – сфероиды из интактной 2D-культуры ММСК, индуцированные на 1-е сутки культивирования. Образцы консервационной среды замораживались при t –80 °С для дальнейшего исследования на содержание в них ФРН и БДНФ методом иммуноферментного анализа.

Результаты. Индукция 3D-сфероидов ММСК лимба способствует значительному увеличению продукции ФРН и НФГМ, однако в дальнейшем наблюдается выраженное снижение секреции этих факторов. Проведение индукции приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости» (дебриса). Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных конструкций. Сфероиды, созданные из индуцированных ММСК, способны к стабильной секреции НТФ, однако уровень секреции факторов значительно меньше по сравнению с группой контроля.

Заключение. 3D-клеточные сфероиды, созданные из 2D-культуры интактных ММСК лимба, могут рассматриваться в качестве клеточного препарата для безопасной и длительной нейропротекции в лечении оптических нейропатий.

1. Бровкина АФ, Щуко ГА. О дифференциальной диагностике некоторых видов оптической нейропатии. Клиническая офтальмология (РМЖ). 2008; 1: 30–33. Brovkina AF, Schuko AG. On differentiated diagnostics of some types of optical neuropathy. Klinicheskaja oftal’mologija (RMZh). 2008; 1: 30–33.

2. Quigley HA, Broman AT. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br. J. Ophthalmol. 2006; 90 (3): 262–267. doi: 10.1136/bjo.2005.081224.

3. EGS Terminology and Guidelines for Glaucoma (3rd Edition). Italy. DOGMA. 2008. 184 p.

4. Conforti L, Adalbert R, Coleman MP. Neuronal death: where does the end begin? Trends Neurosci. 2007; 30 (4): 159–166. doi: 10.1016/j.tins.2007.02.004.

5. Алексеев ВН, Газизова ИР, Никитин ДН. Морфологические особенности центральных отделов зрительного анализатора при экспериментальной глаукоме. Cб. науч. трудов по материалам конференции «Современные технологии диагностики и лечения при поражениях органа зрения». СПб.: ВМедА, 2013: 13–14. Alekseev VN, Gazizova IR, Nikitin DN. Morfologicheskie osobennosti central’nyh otdelov zritel’nogo analizatora pri jeksperimental’noj glaukome. Cb. nauch. trudov po materialam konferencii «Sovremennye tehnologii diagnostiki i lechenija pri porazhenijah organa zrenija ». SPb.: VMedA, 2013: 13–14.

6. Gupta N, Yucel YH. Glaucoma and the brain. J. Glaucoma. 2001; 10: 28–29. PMID: 11890268.

7. Garaci FG, Bolacchi F, Cerulli A, Melis M, Spanò A, Cedrone C et al. Optic Nerve and Optic Radiation Neurodegeneration in Patients with Glaucoma: In vivo Analysis with 3-T Diffusion-Tensor MR Imaging. Radiol. 2009; 2: 496–501. doi: 10.1148/radiol.2522081240.

8. Gupta N, Yucel YH. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 2007; 2: 110–114. doi: 10.1097/ICU.0b013e3280895aea.

9. Levkovitch-Verbin H; Quigley HA; Kerrigan-Baumrind LA; D’Anna SA; Kerrigan D; Pease ME. Optic Nerve Transection in Monkeys May Result in Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cell. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2001; 42: 975–982. PMID: 11274074.

10. Macaya A. Apoptosis in the nervous system. Rev-Neurol. 1996; 135: 1356–1360. PMID: 8974737.

11. Schwartz M. Neurodegeneration and Neuroprotection in Glaucoma: Development of a Therapeutic Neuroprotective Vaccine. Investigative Ophthalmology & Visual Science (The Friedenwald Lecture). April 2003; 44 (4): 1407–1411. doi: 10.1167/iovs.02-0594.

12. Ярилин А.А. Апоптоз и его роль в целостном организме. Глаукома. 2003; 2: 46– 54. Jarilin A.A. Apoptoz i ego rol’ v celostnom organizme. Glaukoma. 2003; 2: 46–54.

13. Goodin S. Erlotinib: optimizing therapy with predictors of response? Clin. Cancer Res. 2006; 12: 2961–2963. PMID: 16707589. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-0426.

14. Chatterjee S, Matsumura A, Schradermeier J, Gillespie GY. Human malignant glioma therapy using antialpha (v) beta3 integrin agents. J. Neurooncol. 2000; 46: 135–144. PMID: 10894366.

15. Braun JS, Novak R, Herzog KH, Bodner SM, Cleveland JL, Tuomanen EI. Neuroprotection by a caspase inhibition in acute bacterial meningitis. Nat. Med. 1999; 5: 298–302. PMID: 10086385. doi: 10.1038/6514.

16. Green AR. Pharmacological approaches to acute ischaemic stroke: reperfusion certainly, neuroprotection possibly. Br. J. Pharmacol. 2008; 153 (1): 325–338. PMID: 18059324. doi: 10.1038/sj.bjp.0707594.

17. Deshmukh M, Vasilakos J, Deckwerth TL, Lampe PA, Shivers BD, Johnson EM Jr. Genetic and metabolic status of NGF-deprived sympathetic neurons saved by an inhibitor of ICE family proteases. J. Cell. Biol. 1996; 135 (5): 1341–1354. PMID 8947555.

18. Гомазков ОА. Старение мозга и нейротрофическая терапия. М.: ИКАР, 2011. 92. Gomazkov OA. Starenie mozga i nejrotroficheskaja terapija. M.: IKAR, 2011. 92.

19. Agarwal N, Agarwal R, Kumar DM, Ondricek A, Clark AF, Wordinger RJ et al. Comparison of expression profile of neurotrophins and their receptors in primary and transformed rat retinal ganglion cells. Molecular Vision. 2007; 13: 1311–1318. PMID: 17679933

20. Lambert W, Agarwal R, Howe W, Clark AF, Wordinger RJ. Neurotrophin and neurotrophin receptor expression by cells of the human lamina cribrosa. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001; 42 (10): 2315–2323. PMID: 11527945

21. Chao MV. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling pathways. Nat. Rev. Neurosci. 2003; 4: 299–309. PMID: 12671646. doi: 10.1038/nrn1078.

22. Rudzinski M, Wong TP, Saragovi HU. Changes in Retinal Expression of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors Induced by Ocular Hypertension. J. Neurobiol. 2004; 58 (3): 341–354. PMID: 14750147. doi: 10.1002/neu.10293.

23. Harper MM, Grozdanic SD, Blits B, Kuehn MH, Zamzow D, Buss JE, Randy H. Kardon et al. Transplantation of BDNF-Secreting Mesenchymal Stem Cells Provides Neuroprotection in Chronically Hypertensive Rat Eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011; 52: 4506–4515. PMID: 21498611. doi: 10.1167/iovs.11-7346.

24. Ko ML, Hu DN, Ritch R, Sharma SC, Chen CF. Patterns of retinal ganglion cell survival after brain-derived neurotrophic factor administration in hypertensive eyes of rats. Neurosci Lett. 2001; 305: 139–142. PMID: 11376903. doi: org/10.1016/S0304-3940(01)01830-4.

25. Martin KR, Quigley HA, Zack DJ, Levkovitch-Verbin H, Kielczewski J, Valenta D et al. Gene Therapy with Brain- Derived Neurotrophic Factor As a Protection: Retinal Ganglion Cells in a Rat Glaucoma Model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003; 44 (10): 4357–4365. PMID: 14507880. doi: 10.1167/iovs.02-1332.

26. Lambiase A, Centofanti M, Micera A, Manni GL, Mattei E, De Gregorio A et al. Nerve growth factor (NGF) reduces and NGF antibody exacerbates retinal damage induced in rabbit by experimental ocular hypertension. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1997; 235 (12):780–785. PMID: 9439971.

27. Siliprandi R, Canella R, Carmignoto G. Nerve Growth Factor Promotes Functional Recovery of Retinal Ganglion Cells After Ischemia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1993; 34 (12): 3232–3245. PMID: 8225858.

28. Lambiase A, Tirassa P, Micera A, Aloe L, Bonini S. Pharmacokinetics of Conjunctivally Applied Nerve Growth Factor in the Retina and Optic Nerve of Adult Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2005; 46 (10): 3800–3806. PMID: 16186366. doi: 10.1167/iovs.05-0301.

29. Crigler L, Robey RC, Asawachaicharn A, Gaupp D, Phinney DG. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. Exp. Neurol. 2006; 198 (1): 54–64. PMID: 16336965. doi: 10.1016/j.expneurol.2005.10.029.

30. Hu Y, Tan HB, Wang XM, Rong H, Cui HP, Cui H. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma. Clinical Interventions in Aging. 2013; 8: 1467–1470. PMID: 24204132. doi: 10.2147/CIA.S47350.

31. Борзенок СА, Сабурина ИН, Репин ВС, Кошелева НВ, Горкун АА, Комах ЮА и др. Методологические и технологические проблемы конструирования искусственной роговицы на базе 3D-клеточного культивирования. Офтальмохирургия. 2012; 4: 12–17. Borzenok SA, Saburina IN, Repin VS, Kosheleva NV, Gorkun AA, Коmakh YuА et al. Methodological and technological problems of artificial cornea engineering based on 3D cellular cultivation. Oftal’mohirurgija. = Ophthalmosurgery. 2012; 4: 12–17.

32. Борзенок СА, Онищенко НА, Тонаева ХД, Комах ЮА, Ковшун ЕВ, Струсова НА. Сотрансплантация ММСК-подобных клеток лимба способствует местной иммунокоррекции и прозрачному приживлению транслантата роговицы при кератопластике высокого риска. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2014; XVI (1): 12–20. Borzenok SA, Onishchenko NA, Tonaeva KhD, Komakh YA, Kovshun YV, Strusova NA. MMSC-Like limbal cells cotransplantation promotes local immunocorrection and corneal graft transparent retention in high risk keratoplasty. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. = Russian Journal of transplantology and artificial organs. 2014; XVI (1): 12–20.

33. Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis. 2008; 14: 431–442. PMID: 18334960.

34. Способ выделения и органотипического культивирования аллогенного лимбального трансплантата. Патент РФ № 2475218 / Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Тонаева Х.Д., Онищенко Н.А., Комах Ю.А., Ковшун Е.В.; Заявитель и патентообладатель ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова » Минздрава России; заявл. 06.12.2011 г.; опубл. 20.02.2013 г. Бюл. 2013; 5. 13. Sposob vydeleniya i organotipicheskogo kul’tivirovaniya allogennogo limbal’nogo transplantata. Patent RF № 2475218 / Borzenok S.A., Malyugin B.E., Tonaeva H.D., Onishchenko N.A., Komah Yu.A., Kovshun E.V.; Zayavitel’ i patentoobladatel’ FGAU «MNTK «Mikrohirurgiya glaza » im. akad. S.N. Fedorova» Minzdrava Rossii; zayavl. 06.12.2011 g.; opubl. 20.02.2013 g. Byul. 2013; 5. 13.

35. Sadan O, Bahat-Stromza M, Barhum Y, Levy YS, Pisnevsky A, Peretz H et al. Protective effects of neurotrophic factors secreting cells in a 6OHDA rat model of Parkinson disease. Stem. Cells Dev. 2009; 18 (8): 1179–1190. PMID: 19243240. doi: 10.1089/scd.2008.0411.

36. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8 (4): 315–317. PMID: 16923606. doi: 10.1080/14653240600855905.

37. Folkman J, Hochberg M. Self-regulation of growth in three dimensions. J. Exp. Med. 1973; 138 (4): 745–753.