ОПЫТ ПЕРФУЗИОННОЙ РЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО КАРКАСА ЛЕГКИХ КРЫСЫ

Цель исследования – оценить перспективы использования процессов децеллюляризации и рецеллюляризации легких крысы как начального этапа создания тканеинженерных конструкций.

Материалы и методы. Децеллюляризацию легких крысы выполняли перфузионным детергент-энзиматическим методом при сопутствующей вентиляции трахеи атмосферным воздухом. Качество проведенной децеллюляризации оценивали с использованием рутинных гистологических и иммуногистохимических методов исследования, количественное содержание ДНК определяли спектрофотометрически. Для статической рецеллюляризации и перфузионной рецеллюляризации целого органа в качестве модели для изучения поведения клеток на каркасе использовали мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки с последующей оценкой метаболической активности клеток колориметрическим методом и их жизнеспособности – путем окрашивания кальцеином и гомодимером этидия. Для качественной оценки матрикса легких после рецеллюляризации использовали иммуногистохимический анализ.

Результаты. 92% аллогенной ДНК удалено при проведении децеллюляризации. Гистологическое окрашивание не выявило остаточных клеток и клеточных ядер при сохранности волокон внеклеточного матрикса, что подтверждалось иммуногистохимической реакцией матрикса с антителами к ламинину, эластину, фибронектину, коллагенам I и IV типов до и после проведения децеллюляризации. Каркас при заселении клетками не проявляет токсических свойств, поддерживает жизнеспособность и метаболическую активность клеток.

Заключение. Полученный опыт децеллюляризации и рецеллюляризации легких крысы является перспективной основой для разработки протоколов создания тканеинженерных легких.

1. Gilpin SE, Ott HC. Using Nature’s Platform to Engineer Bio-Artificial Lungs. Annals ATS. 2015; 12 (1): 45–49.

2. Badylak SF, Taylor D, Uygun K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev. Biomed. Eng. 2011; 13: 27–53.

3. Куевда ЕВ, Губарева ЕА, Сотниченко АС, Гилевич ИВ, Гуменюк ИС, Поляков ИС и др. Детергентно-энзиматический метод децеллюляризации легких крысы. Морфологическая оценка матрикса. Современные проблемы науки и образования. 2015; 3; URL: www.science-education.ru/123-17759. Kuevda EV, Gubareva

4. EA, Sotnichenko AS, Gilevich IV, Gumenyuk IS, Polyakov IS et al. Detergent-enzymatic method of rat lung decellularization. Matrix morphological evaluation. Sovremennye problemy nauki i obrazovanija = Modern problems of science and education. 2015; 3; URL: www.science-education.ru/123-17759. [In Russ, English abstract].

5. O’Neill JD. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 2013; 96: 1046–1056.

6. Tsuchiya T, Sivarapatna A, Rocco K, Nanashima A, Naga yasu T, Niklason LE. Future prospects for tissue engineered lung transplantation. Decellularization and recellularization-based whole lung regeneration. Organogenesis. 2014; 10 (2): 196–207.

7. Patent RF № 2547799 / 16.03.2015. P Macchiarini, EA Gubareva, EV Kuevda, IV Gilevich, Ph Jungebluth. Sposob sozdanija bioinzhenernogo karkasa legkogo krysy // Patent Rossii № 2547799. 24.12.2013.

8. Jungebluth Ph, Haag JC, Sjöqvist S, Gustafsson Y, Rodríguez AB, Del Gaudio C et al. Tracheal tissue engineering in rats. Nature protocols. 2014; 9 (9): 2164–2179.

9. Baiguera S, Del Gaudio C, Lucatelli E, Kuevda E, Boieri M, Mazzanti B et al. Electrospun gelatin scaffolds incorporating rat decellularized brain extracellular matrix for neural tissue engineering. Biomaterials. 2014; 35: 1205–1214.

10. Shachpazyan NR, Astrelina TA, Yakovleva MV. Mesenchymal stem cells from various human tissues: biological properties, assessment of quality and safety for clinical use. Kletochnaja transplantologija i tkanevaja inzhenerija = Сells transplantation and tissue engineering. 2012; 7 (1): 23–33. [In Russ, English abstract].

11. Lamprecht MR, Sabatini DM, Carpenter AE. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 2007; 42 (1): 71–75; PMID: 17269487.

12. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.

13. The International Society for Cellular Therapy positionstatement. Cytotherapy. 2006; 8 (4): 315–317; doi:10.1080/14653240600855905; PMID: 16923606.

14. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006; 27: 3675–3683.

15. Gilbert TW. Strategies for tissue and organ decellularization. J. Cell Biochem. 2012; 113 (7): 2217–2222.