ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO ВОЗМОЖНОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ СФЕРОИДНЫХ МИКРОАГРЕГАТОВ ДОНОРСКОГО РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ

Цель. Изучить в эксперименте in vitro критерии трансплантабельности многоклеточных сфероидных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия (РПЭ), подготовленных методом 3D-клеточного культивирования.

Материалы и методы. 11 донорских глаз (6 с показателем адреналиновой пробы «А», 5 – с показателем «В») использовали в качестве источника клеточных культур РПЭ (группа «А» – 6 культур, группа «В» – 5 культур), из которых методом трехмерного клеточного культивирования было получено свыше 2000 сфероидов РПЭ, из которых отобрали 1760 (960 – группа «А», 800 – группа «В»). Среди отобранных сфероидов было одинаковое количество сфероидов разной морфологии («гладкие» и «бахромчатые») и изначального посевного количества клеток (500, 1000, 5000, 25 000, 125 000). По 12 сфероидов группы «А» и по 10 группы «В» выводили из 3D-культуры для оценки жизнеспособности в сроки 7, 14, 21, 28 суток 3D-культивирования. Такое же количество сфероидов в те же сроки переводили из 3D-культуры в 2D-условия для оценки их адгезивных свойств. Жизнеспособность клеток в составе сфероидов определяли при помощи теста с трипановым синим. Наличие или отсутствие адгезии определяли при микроскопическом наблюдении.

Результаты. «Гладкие» сфероиды 7 и 14 дней предтрансплантационного культивирования и посевных количеств 500 и 1000 клеток на висячую каплю показали наивысшую трансплантабельность (жизнеспособность клеток от 0,83 ± 0,38 до 0,94 ± 0,24, стопроцентная адгезия сфероидов). «Бахромчатые» сфероиды оказались нетрансплантабельны во всех вариантах, несмотря на частичное сохранение их жизнеспособности (при сравнении с «гладкими» по всем параметрам p < 0,05). Сроки предтрансплантационного культивирования 21 и 28 дней и высокие посевные количества клеток достоверно снижают трансплантабельность сфероидов (p > 0,05 для низких посевных количеств, p < 0,05 – для высоких). Различия в показателях адреналиновой пробы А и В донорских глаз, явившихся первичными источниками клеточного материала, на трансплантабельность сфероидов не влияют (p > 0,05).

Заключение. Среди сфероидов РПЭ, получаемых по разработанной нами методике, лучшей трансплантабельностью обладают сфероиды с «гладкой» поверхностью, культивированные перед трансплантацией в 3D-условиях в течение 7–14 дней и полученные при посевных количествах 500 и 1000 клеток РПЭ на одну висячую каплю.

1. Bourne RR, Stevens GA, White RA, Smith JL, Flaxman SR, Price H et al. Vision Loss Expert Group. Causes of vision loss worldwide, 1990–2010: a systematic analysis. Lancet Glob Health. 2013 Dec; 1 (6): e339–349. doi: 10.1016/S2214-109X(13)70113-X.

2. Fernández-Robredo P, Sancho A, Johnen S, Recalde S, Gama N, Thumann G et al. Current treatment limitations in age-related macular degeneration and future approaches based on cell therapy and tissue engineering. J Ophthalmol. 2014; 2014: 510285. doi: 10.1155/2014/510285.

3. Binder S, Stanzel BV, Krebs I, Glittenberg C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. 2007 Sep; 26 (5): 516–554.

4. Binder S, Krebs I, Hilgers RD, Abri A, Stolba U, Assadoulina A et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004 Nov; 45 (11): 4151–4160.

5. Борзенок СА, Попов ИА, Островский ДС, Сабурина ИН, Кошелева АВ, Зурина ИМ. Конструирование трансплантатов донорского ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования. Бюллетень СО РАМН. 2014, 34 (3): 42–47. Borzenok SA, Popov IA, Ostrovsky DS, Saburina IN, Kosheleva AV, Zurina IM. The Construction of Transplants of Human Cadaveric Donor Retinal Pigment Epithelium by the Method of 3D Cellular Culture. Bjulleten' SO RAMN. 2014, 34 (3): 42–47 [In Russ, English abstract].

6. Борзенок СА. Медико-технологические и методологические основы эффективной деятельности глазных тканевых банков России в обеспечении операций по сквозной трансплантации роговицы. Дис. … д. м. н. М., 2008: 306. Borzenok SA. Mediko-tehnologicheskie i metodologicheskie osnovy jeffektivnoj dejatel'nosti glaznyh tkanevyh bankov Rossii v obespechenii operacij po skvoznoj transplantacii rogovicy. Dis. … d. m. n. M., 2008: 306.

7. Sato R, Yasukawa T, Kacza J, Eichler W, Nishiwaki A, Iandiev I et al. Three-dimensional spheroidal culture visualization of membranogenesis of Bruch's membrane and basolateral functions of the retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013 Mar 11; 54 (3):1740–1749.

8. Repin VS, Saburina IN, Kosheleva NV, Gorkun AA, Zurina IM, Kubatiev AA. 3D-technology of the formation and maintenance of single dormant microspheres from 2000 human somatic cells and their reactivation in vitro. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014; 158; 1: 137–144.

9. Folkman J, Hochberg M. Self-regulation of growth in three dimensions. J Exp Med. 1973 Oct 1; 138 (4): 745–753.

10. Tezel TH, Del Priore LV. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1997 Jan; 235 (1): 41–47.