ИССЛЕДОВАНИЕ НАНО- И МИКРОСТРУКТУРЫ БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ

Цель. Провести исследование трехмерной микро- и наноструктуры пористых биосовместимых матриксов и выполнить количественный анализ наномасштабной пористости.

Материалы и методы. Трехмерные пористые матриксы из высокоочищенного спидроина rS1/9 (рекомбинантного аналога белка паутины) были получены методом выщелачивания. Размер макропор полученных трехмерных матриксов составил от 200 до 400 мкм. Изучение трехмерной структуры матриксов производилось методом сканирующей зондовой нанотомографии при помощи экспериментальной установки, объединяющей ультрамикротом и сканирующий зондовый микроскоп.

Результаты. Получена трехмерная нанотомографическая реконструкция структуры стенки макропоры матрикса. Установлено, что в объеме стенок макропор исследуемых матриксов формируется трехмерная сеть сообщающихся пор и каналов с размерами от 20 до 700 нм. Средний диаметр пор составляет 150 нм. Объемный коэффициент пористости стенок макропор составляет 22%, при этом объемная доля пор, взаимосвязанных между собой и соединяющихся в кластеры, составляет порядка 20% от объема всех пор.

Заключение. Полученные в результате исследования количественные характеристики пористой микро- и наноструктуры матриксов показывают заметную степень наномасштабной пористости и проницаемости стенок макропор, что коррелирует с высокой эффективностью регенерации тканей на подобных матриксах при их имплантации in vivo. Использование метода сканирующей зондовой нанотомографии для анализа характеристик и топологии систем микро-и нанопор позволяет повысить эффективность разработок по созданию новых биосовместимых и биодеградируемых материалов с заданными морфологическими, физико-химическими и биологическими характеристиками.

1. Pilhofer M, Ladinsky MS, McDowall AW, Jensen GJ. Bacterial TEM: new insights from cryomicroscopy. Methods Cell Biol. 2010; 96: 21–45. doi: 10.1016/S0091- 679X(10)96002-0.

2. Bouchet-Marquis C, Hoenger A. Cryo-electron tomography on vitrifi ed sections: a critical analysis of benefi ts and limitations for structural cell biology. Micron. 2011; 42 (2): 152–162. doi: 10.1016/j.micron.2010.07.003.

3. Matsko N. Atomic force microscopy applied to study macromolecular content of embedded biological material. Ultramicroscopy. 2007; 107: 95–105. doi: 10.1016/j. ultramic.2006.05.009.

4. Gallyamov MO. Scanning Force Microscopy as Applied to Conformational Studies in Macromolecular Research. Macromolecular Rapid Communications. 2011; 32 (16): 1210–1246. doi: 10.1002/marc.201100150.

5. Efi mov AE, Tonevitsky AG, Dittrich M, Matsko NB. Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: a novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy. 2007; 226 (3): 207–217.

6. Walther P, Müller M. Biological ultrastructure as revealed by high resolution cryo-SEM of block faces after cryo-sectioning. Journal of Microscopy. 1999; 196 (3): 279–287.

7. Alekseev A, Efi mov A, Lu K, Loos J. Three-dimensional electrical property reconstruction of conductive nanocomposites with nanometer resolution. Advanced Materials. 2009; 21 (48): 4915–4919.

8. Mochalov KE, Efi mov AE, Bobrovsky AYu, Agapov II, Chistyakov AA, Oleinikov VA, Nabiev I. High-resolution 3D structural and optical analyses of hybrid or composite materials by means of scanning probe microscopy combined with the ultramicrotome technique: an example of application to engineering of liquid crystals doped with fl uorescent quantum dots. Proceedings PIE. 2013; 8767: 876708. doi:10.1117/12.2017088.

9. Mochalov KE, Efi mov AE, Bobrovsky A, Agapov II, Chistyakov AA, Oleinikov VA et al. Combined Scanning Probe Nanotomography and Optical Microspectroscopy: A Correlative Technique for 3D Characterization of Nanomaterials. ACS Nano. 2013; 7 (10): 8953–8962. doi: 10.1021/nn403448p.

10. Matsko N. Atomic force microscopy applied to study macromolecular content of embedded biological material. Ultramicroscopy. 2007; 107: 95–105.

11. Matsko N, Mueller M. AFM of biological material embedded in epoxy resin. J. Struct. Biol. 2004; 146: 334–343.

12. Василец ВН, Казбанов ИВ, Ефимов АЕ, Севастьянов ВИ. Разработка новых методов формирования имплантационных материалов с использованием технологий электроспиннинга и биопринтирования. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2009; 9 (2): 47–53. Vasilets VN, Kazbanov IV, Efimov AE, Sevastianov VI. New methods for implant matrix formation based on electrospinning and bioprinting technologies. Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. 2009; 9 (2): 47–53.

13. Efi mov AE, Gnaegi H, Schaller R, Grogger W, Hofer F, Matsko NB. Analysis of native structure of soft materials by cryo scanning probe tomography. Soft Matter. 2012; 8: 9756–9760. doi:10.1039/c2sm26050f.

14. Bleeker MAK, Smid HM, Van Aelst AC, Van Loon JJA, Vet LEM. Antennal Sensilla of Two Parasitoid Wasps: A Comparative Scanning Electron Microscopy Study. Microsc. Res. Techniq. 2004; 63 (5): 266–273.

15. Mandal BB, Kundu SC. Cell proliferation and migration in silk fibroin 3D scaffolds. Biomaterials. 2009; 30: 2956–2965.

16. Gao J, Crapo PM, Wang Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 2006; 12: 917–925.

17. Ho MH, Kuo PY, Hsieh HJ, Hsien TY, Hou LT, Lai JY, Wang DM. Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods. Biomaterials. 2004; 25: 129–138.

18. Zong X, Bien H, Chung CY, Yin L, Fang D, Hsiao BS et al. Electrospun fi ne-textured scaffolds for heart tissue constructs. Biomaterials. 2005; 26: 5330–5338.

19. Moisenovich MM, Pustovalova O, Shackelford J, Vasiljeva TV, Druzhinina, TV, Kamenchuk YA et al. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds. Biomaterials. 2012; 33 (15): 3887–3898.

20. Bogush VG, Sokolova OS, Davydova LI, Klinov DV, Sidoruk KV, Esipova NG et al. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. J. Neuroimmune Pharmacol. 2009; 4: 17–27.

21. Moisenovich MM, Pustovalova OL, Arhipova AY, Vasiljeva TV, Sokolova OS, Bogush VG et al. In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 2011; 96 (1): 125–131.

22. Scher H, Zallen R. Critical density in percolation processes. J. Chem. Phys. 1970; 53: 3759–3761.

23. Hunt A, Ewing R. Percolation Theory for Flow in Porous Media. Lect. Notes Phys. Springer: Berlin Heidelberg, 2009; 771.