Химическая децеллюляризация ткани печени свиньи путем двухэтапной обработки поверхностно-активными и осморегулирующими веществами способствует повышению сохранности структуры внеклеточного матрикса печени

Цель: разработать и исследовать тканеспецифический матрикс, полученный с применением модифицированного режима химической децеллюляризации фрагментов печени свиньи, направленного на эффективное повышение сохранности структуры внеклеточного матрикса (ВКМ), сокращение срока децеллюляризации и улучшение очистки матрикса от клеточных элементов. Материалы и методы. Исходную ткань свиной печени измельчали для получения тканевых фрагментов. Применяли 5 режимов децеллюляризации, последовательно меняя концентрации и сроки обработки поверхностно-активными веществами (ПАВ): 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) и 0,1% или 1% Triton X-100, без и в сочетании с фосфатно-солевым буфером (PBS). Содержание гликозаминогликанов (ГАГ) в полученных фрагментах определяли, лизируя образцы 12 ч в растворе папаина при +65 °С с последующей инкубацией в красителе – 1,9-диметилметиленовом синем. Количественное определение ДНК в образцах проводили с применением набора DNeasy Blood&Tissue Kit и красителя Quant-iT PicoGreen. Морфологию образцов исследовали с использованием гистологических методов окрашивания. Цитотоксичность полученных образцов in vitro оценивали на культуре фибробластов мыши линии NIH/3T3 методом прямого контакта. Результаты. Обработка ткани 0,1% SDS в течение 2,5 ч с дополнительной обработкой 1% Triton X-100, содержащим PBS, в течение 21,5 ч (режим 4) способствовала повышению ГАГ до 11,66 ± 0,61 мкг/мг по сравнению с 0,68 ± 0,06 мкг/мг (режим 5). Дополнительная обработка образцов, полученных в режиме 4, ДНКазой I типа позволила снизить содержание ДНК с 99,75 ± 3,93 до 14,93 ± 4,91 нг/мг, что свидетельствовало об эффективном удалении клеточных компонентов. Цитотоксичность этого матрикса не обнаружена. Заключение. Оптимизация режима химической децеллюляризации фрагментов печени свиньи позволила повысить сохранность структур ВКМ, сократить время децеллюляризации и эффективно снизить содержание клеточных элементов. Модифицированный протокол децеллюляризации фрагментов печени свиньи позволил получить нецитотоксичный тканеспецифический матрикс с низкой потенциальной иммуногенностью и более сохранной структурой ВКМ и количеством ГАГ.

1. Dai Q, Jiang W, Huang F, Song F, Zhang J, Zhao H. Recent advances in liver engineering with decellularized scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2022; 10: 831477. doi: 10.3389/fbioe.2022.831477.

2. Zhang X, Chen X, Hong H, Hu R, Liu J, Liu C. Decellularized extracellular matrix scaffolds: Recent trends and emerging strategies in tissue engineering. Bioact Mater. 2021; 10: 15–31. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.09.014.

3. Isaeva EV, Beketov EE, Arguchinskaya NV, Ivanov SА, Shegay PV, Kaprin AD. Decellularized Extracellular Matrix for Tissue Engineering (Review). Sovrem Tekhnologii Med. 2022; 14 (3): 57–68. doi: 10.17691/stm2022.14.3.07.

4. García-Gareta E, Abduldaiem Y, Sawadkar P, Kyriakidis C, Lali F, Greco KV. Decellularised scaffolds: just a framework? Current knowledge and future directions. J Tissue Eng. 2020; 11: 2041731420942903. doi: 10.1177/2041731420942903.

5. Biomimetics of Extracellular Matrices for Cell and Tissue Engineered Medical Products / Ed. V.I. Sevastianov, Yu.B. Basok. Newcastle upon Tyne, UK: Cambridge Scholars Publishing, 2023; 339.

6. Sodhi H, Panitch A. Glycosaminoglycans in tissue engineering: a review. Biomolecules. 2020; 11 (1): 29. doi: 10.3390/biom11010029.

7. Huang Z, Godkin O, Schulze-Tanzil G. The challenge in using mesenchymal stromal cells for recellularization of decellularized cartilage. Stem Cell Rev Rep. 2017; 13 (1): 50–67. doi: 10.1007/s12015-016-9699-8.

8. Neishabouri A, Soltani Khaboushan A, Daghigh F, Kajbafzadeh AM, Majidi Zolbin M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotechnol. 2022; 10: 805299. doi: 10.3389/fbioe.2022.805299.

9. Jeong W, Kim MK, Kang HW. Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks. J Tissue Eng. 2021; 12: 2041731421997091. doi: 10.1177/2041731421997091.

10. Willemse J, Verstegen MMA, Vermeulen A, Schurink IJ, Roest HP, van der Laan LJW, de Jonge J. Fast, robust and effective decellularization of whole human livers using mild detergents and pressure controlled perfusion. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020; 108: 110200. doi: 10.1016/j.msec.2019.110200.

11. Немец ЕА, Малкова АП, Духина ГА, Лажко АЭ, Басок ЮБ, Кириллова АД, Севастьянов ВИ. Влияние сверхкритического диоксида углерода на биосовместимые и резорбтивные свойства in vivo тканеспецифических матриксов из децеллюляризованных фрагментов печени свиньи. Перспективные материалы. 2021; 11: 20–31. doi: 10.30791/1028-978X-2021-11-20-31.

12. Gilpin A, Yang Y. Decellularization strategies for regenerative medicine: from processing techniques to applications. Biomed Res Int. 2017; 2017: 9831534. doi: 10.1155/2017/9831534.

13. Syed O, Walters NJ, Day RM, Kim HW, Knowles JC. Evaluation of decellularization protocols for production of tubular small intestine submucosa scaffolds for use in oesophageal tissue engineering. Acta Biomater. 2014; 10 (12): 5043–5054. doi: 10.1016/j.actbio.2014.08.024.

14. Sevastianov VI, Basok YuB, Grigoriev AM, Nemets EA, Kirillova AD, Kirsanova LA et al. Decellularization of cartilage microparticles: Effects of temperature, supercritical carbon dioxide and ultrasound on biochemical, mechanical, and biological properties. J Biomed Mater Res A. 2023; 111 (4): 543–555. doi: 10.1002/jbm.a.37474.

15. Bakhtiar H, Rajabi S, Pezeshki-Modaress M, Ellini MR, Panahinia M, Alijani S et al. Optimizing methods for bovine dental pulp decellularization. J Endod. 2021; 47 (1): 62–68. doi: 10.1016/j.joen.2020.08.027.

16. Kobes JE, Georgiev GI, Louis AV, Calderon IA, Yoshimaru ES, Klemm LM et al. A comparison of iron oxide particles and silica particles for tracking organ recellularization. Mol Imaging. 2018; 17: 1536012118787322. doi: 10.1177/1536012118787322.

17. Kim JK, Koh YD, Kim JO, Seo DH. Development of a decellularization method to produce nerve allografts using less invasive detergents and hyper/hypotonic solutions. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2016; 69 (12): 1690–1696. doi: 10.1016/j.bjps.2016.08.016.

18. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.

19. Suss PH, Ribeiro VST, Motooka CE, de Melo LC, Tuon FF. Comparative study of decellularization techniques to obtain natural extracellular matrix scaffolds of human peripheral-nerve allografts. Cell Tissue Bank. 2022; 23 (3): 511–520. doi: 10.1007/s10561-021-09977-x.

20. Немец ЕА, Кирсанова ЛА, Басок ЮБ, Шагидулин МЮ, Волкова ЕА, Метельский СТ, Севастьянов ВИ. Особенности технологии децеллюляризации фрагментов печени человека как тканеспецифического мелкодисперсного матрикса для клеточно-инженерной конструкции печени. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2017; 19 (4): 70–77. doi: 10.15825/1995-1191-2017-4-70-77.

21. Кириллова АД, Басок ЮБ, Лажко АЭ, Григорьев АМ, Кирсанова ЛА, Немец ЕА, Севастьянов ВИ. Создание тканеспецифического микродисперсного матрикса из децеллюляризованной печени свиньи. Физика и химия обработки материалов. 2020; 4: 41–50. doi: 10.30791/0015-3214-2020-4-41-50.

22. ГОСТ ISO 10993-5-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. М.: Стандартинформ, 2014; 9. doi: 10.1242/dev.114215.

23. Zhou J, Fritze O, Schleicher M, Wendel HP, SchenkeLayland K, Harasztosi C et al. Impact of heart valve decellularization on 3-D ultrastructure, immunogenicity andthrombogenicity. Biomaterials. 2010; 31 (9): 2549– 2554. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.11.088.

24. O’Neill JD, Anfang R, Anandappa A, Costa J, Javidfar J, Wobma HM et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 2013; 96 (3): 1046–1056. doi: 10.1016/j.athoracsur.2013.04.022.

25. Sullivan DC, Mirmalek-Sani SH, Deegan DB, Baptista PM, Aboushwareb T, Atala A, Yoo JJ. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 2012; 33 (31): 7756–7764. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.07.023.