Биологические свойства макропористого криоструктурата на основе компонентов внеклеточного матрикса

Цель работы: исследование биологических свойств макропористого криоструктурата из концентрированного коллагенсодержащего раствора в качестве перспективной матрицы для формирования клеточно- и тканеинженерных конструкций.

Материалы и методы. Макропористый губчатый носитель получали методом криоструктурирования коллагенсодержащего экстракта, приготовленного путем уксуснокислого гидролиза соединительной ткани цыплят (АО «БИОМИР сервис», РФ). Для придания водонерастворимости криоструктурату использовали N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимид (Sigma-Aldrich, США). Исследование микроморфологии поверхности губки проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии. Цитотоксичность носителя оценивали по реакции клеточной культуры фибробластов мыши NIH 3T3 с использованием автоматического микроскопа IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, США). Биосовместимость макропористого носителя изучали на культурах мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч), линейных клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 и линейных клетках эндотелия пупочной вены человека EA.hy926. Определяли метаболическую активность клеток с использованием реагентов PrestoBlue™ (Invitrogen™, США). Развитие клеточной популяции при долговременном культивировании клеточно-инженерной конструкции (КИК) оценивали с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии по всей поверхности образца с использованием инвертированного микроскопа Leica Dmi8 с програмным обеспечением Leica Thunder (Leica Microsystems, ФРГ).

Результаты. Оптическая микроскопия и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показали наличие в полученном биополимерном материале пор разного размера: крупных, диаметром 237 ± 32 мкм, средних – 169 ± 23 мкм и малых – 70 ± 20 мкм; преимущественно наблюдали поры крупных и средних размеров. Исследуемые носители не проявляли цитотоксичности. Наблюдали адгезию и пролиферацию клеток на поверхности материала и их проникновение в подлежащие слои при долговременном культивировании. Наибольшая метаболическая активность клеток наблюдалась для МСК ЖТч на 14-е сутки, что соответствует нормальной динамике развития популяции клеток данного типа. В модели КИК печени была показана функциональная активность клеток HepG2 – продуцирование альбумина и мочевины.

Заключение. Хорошая адгезия и активная пролиферация, показанная для трех типов клеток, свидетельствует о биосовместимости полученного биополимерного носителя, а распространение клеток во внутренний объем губки и ее активное заселение при долговременном культивировании указывает на целесообразность использования данного материала для создания клеточно- и тканеинженерных конструкций.

1. Трансплантология и искусственные органы: учебник / Под ред. акад. РАН С.В. Готье. М.: Лаборатория знаний, 2018; 319 с.: ил.

2. Yamamoto T, Randriantsilefisoa R, Sprecher CM, D’Este M. Fabrication of collagen-hyaluronic acid cryogels by directional freezing mimicking cartilage arcadelike structure. Biomolecules. 2022 Dec 3; 12 (12): 1809. doi: 10.3390/biom12121809.

3. Mirdamadi ES, Kalhori D, Zakeri N, Azarpira N, Solati-Hashjin M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Eng Part B Rev. 2020 Apr; 26 (2): 145–163. doi: 10.1089/ten.teb.2019.0233.

4. Zhang L, Guan Z, Ye JS, Yin YF, Stoltz JF, de Isla N. Research progress in liver tissue engineering. Biomed Mater Eng. 2017; 28 (s1): S113–S119. doi: 10.3233/BME171632.

5. Wise JK, Yarin AL, Megaridis CM, Cho M. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on oriented nanofibrous scaffolds: engineering the superficial zone of articular cartilage. Tissue Eng Part A. 2009 Apr; 15 (4): 913–921. doi: 10.1089/ten.tea.2008.0109.

6. Daly AC, Kelly DJ. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 2019 Mar; 197: 194–206. doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.12.028.

7. Schwab A, Hélary C, Richards RG, Alini M, Eglin D, D’Este M. Tissue mimetic hyaluronan bioink containing collagen fibers with controlled orientation modulating cell migration and alignment. Mater Today Bio. 2020 Jun 1; 7: 100058. doi: 10.1016/j.mtbio.2020.100058.

8. Лозинский ВИ. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения – полимерные криогели. Известия РАН. Серия химическая. 2008; (5): 996–1014. doi: 10.1007/s11172-008-0131-7.

9. Lozinsky VI. Cryostructuring of polymer systems. 50.† Cryogels and cryotropic gel-formation: terms and definitions. Gels. 2018; 4 (3): 77. doi: 10.3390/gels4030077.

10. Henderson TMA, Ladewig K, Haylock DN, McLean KM, O’Connor AJ. Cryogels for biomedical applications. J Mater Chem B. 2013; 1 (21): 2682–2695. doi: 10.1039/c3tb20280a.

11. Memic A, Colombani T, Eggermont LJ, Rezaeeyazdi M, Steingold J, Rogers ZJ et al. Latest advances in cryogel technology for biomedical applications. Adv Ther. 2019; 2 (4): 1800114. doi: 10.1002/adtp.201800114.

12. Lozinsky VI. Cryostructuring of polymeric systems. 55. Retrospective view on the more than 40-years studies performed in the A.N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds with respect of the cryostructuring processes in polymeric systems. Gels. 2020; 6 (3): 29. doi: 10.3390/gels6030029.

13. Shiekh PA, Andrabi SV, Singh A, Majumder S, Kumar A. Designing cryogels through cryostructuring of polymeric matrices for biomedical applications. Eur Polym J. 2021; 144; 110234. doi: 10.1016/j.eurpolymj.2020.110234.

14. Ma Y, Wang X, Su T, Lu F, Chang Q, Gao J. Recent advances in macroporous hydrogels for cell behavior and tissue engineering. Gels. 2022 Sep 21; 8 (10): 606. doi: 10.3390/gels8100606.

15. Omidian H, Chowdhury SD, Babanejad N. Cryogels: advancing biomaterials for transformative biomedical applications. Pharmaceutics. 2023 Jun 27; 15 (7): 1836. doi: 10.3390/pharmaceutics15071836.

16. Lozinsky VI, Okay O. Basic principles of cryotropic gelation. Adv Polym Sci. 2014; 263: 49–102. doi: 10.1007/978-3-319-05846-7_2.

17. Севастьянов ВИ, Григорьев АМ, Басок ЮБ, Кирсанова ЛА, Василец ВН, Малкова АП и др. Биосовместимые и матриксные свойства полилактидных губок. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2018; 20 (2): 82–90. https://doi.org/10.15825/1995-1191-2018-2-82-90.

18. Bhaskar B, Rao PS, Kasoju N, Nagarjuna V, Baadhe RR (Eds.). Biomaterials in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. From Basic Concepts to State of the Art Approaches. Springer Nature Singapore Pte Ltd., 2021; 1039. https://doi.org/10.1007/978-981-16-0002-9.

19. Sevastianov VI, Basok YB, Kirsanova LA, Grigoriev AM, Kirillova AD, Nemets EA et al. A Comparison of the Capacity of Mesenchymal Stromal Cells for Cartilage Regeneration Depending on Collagen-Based Injectable Biomimetic Scaffold Type. Life (Basel). 2021 Jul 27; 11 (8): 756. doi: 10.3390/life11080756.

20. Севастьянов ВИ, Перова НВ. Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ – инъекционный биодеградируемый имплантат для заместительной и регенеративной медицины. Практическая медицина. 2014; 8 (84): 120–126.

21. DeQuach JA, Mezzano V, Miglani A, Lange S, Keller GM, Sheikh F, Christman KL. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS ONE. 2010; 5 (9): e13039. doi: 10.1371/journal.pone.0013039.

22. Лозинский ВИ, Кулакова ВК, Колосова ОЮ, Басок ЮБ, Григорьев АМ, Перова НВ, Севастьянов ВИ. Биополимерный материал для клеточно-инженерных и/или тканеинженерных конструкций и способ его получения. Пат. РФ № 2774947 (2021); Б.И. № 18 (2022).

23. Григорьев АМ, Басок ЮБ, Кириллова АД, Сургученко ВА, Шмерко НП, Кулакова ВК и др. Криогенно-структурированный гидрогель на основе желатина как резорбируемая макропористая матрица для биомедицинских технологий. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2022; 24 (2): 83–93. https://doi.org/10.15825/1995-1191-2022-2-83-93.

24. Lozinsky VI, Kulakova VK, Grigoriev AM, Podorozhko EA, Kirsanova LA, Kirillova AD et al. Cryostructuring of polymeric systems: 63. Synthesis of two chemically tanned gelatin-based cryostructurates and evaluation of their potential as scaffolds for culturing of mammalian cells. Gels. 2022 Oct 28; 8 (11): 695. doi: 10.3390/gels8110695.

25. Novikov I, Subbot A, Turenok A, Mayanskiy N, Chebotar I. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride. Micron. 2019; 124: 102687. doi: 10.1016/j.micron.2019.102687.

26. Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 109935-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro».