Криогенно-структурированный гидрогель на основе желатина как резорбируемая макропористая матрица для биомедицинских технологий

Цель: исследование биологических свойств матрицы из криогенно-структурированного гидрогеля в форме макропористой желатиновой губки, а также возможности создания на ее основе клеточно-инженерных конструкций. Материалы и методы. Основными компонентами криогенно-структурированного гидрогеля были желатин (тип А), полученный из коллагена свиной кожи, N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимид, (ЭДК) и мочевина (все – Sigma-Aldrich, США). Морфологию поверхности исследовали с использованием сканирующей электронной микроскопии. Степень набухания в воде образцов определяли гравиметрическим методом. Цитотоксичность исследовали на фибробластах мыши линии NIH 3T3 и мезенхимальных стромальных клетках жировой ткани человека (МСК ЖТч) с использованием IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, США). Метаболическую активность МСК ЖТч оценивали с помощью реагентов PrestoBlue™ (Invitrogen™, США). Для создания клеточно-инженерных конструкций (КИК) использовали МСК ЖТч, клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 или эндотелиальные клетки пупочной вены человека линии EA.hy926. Содержание альбумина в культуральной среде определяли методом иммуноферментного анализа. Скорость метаболизма аммиака оценивали после 90 минут инкубации с 1 mM хлоридом аммония (Sigma-Aldrich, США), разведенным в культуральной среде на 15-е сутки эксперимента. Результаты. Получение матрицы из криогенно-структурированного гидрогеля в форме макропористой желатиновой губки включало замораживание водного раствора смеси желатина и мочевины, удаление поликристаллов замерзшего растворителя лиофилизацией, экстракцию мочевины этанолом и обработку криоструктурата этанольным раствором ЭДК. Сканирующая электронная микроскопия позволила выделить три типа пор на поверхности носителя: крупные (109 ± 17 мкм), средние (39 ± 10 мкм) и малые (16 ± 6 мкм). Степень набухания в воде образцов матрицы составила 3,8 ± 0,2 г Н₂О на 1 г сухого полимера. Установлена способность макропористой желатиновой губки в составе КИК поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч, эндотелиальных клеток пупочной вены человека линии EA.hy926 и HepG2 в течение 28, 15 и 9 суток соответственно. Доказано наличие секреции альбумина и метаболизма аммиака при культивировании клеток HepG2 на желатиновой губке. Заключение. На примере клеточно-инженерной конструкции печени показана перспективность использования матрицы из макропористого криогенно-структурированного гидрогеля на основе желатина для создания продуктов тканевой инженерии.

1. Трансплантология и искусственные органы: учебник / Под ред. акад. РАН СВ Готье. М.: Лаборатория знаний, 2018. 319 с.: ил.

2. Biomaterials in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. From Basic Concepts to State of the Art Approaches. B Bhaskar, PS Rao, N Kasoju, V Nagarjuna, RR Baadhe (Eds.). Springer Nature Singapore Pte Ltd.; 2021. 1039 p. ISBN 978-981-16-0001-2. doi 10.1007/978-981-16-0002-9.

3. Joyce K, Fabra GT, Bozkurt Y, Pandit A. Bioactive potential of natural biomaterials: identification, retention and assessment of biological properties. Signal Transduct Target Ther. 2021; 6 (1): 122. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00512-8.

4. Dong C, Lv Y. Application of Collagen Scaffold in Tissue Engineering: Recent Advances and New Perspectives. Polymers (Basel). 2016; 8 (2): 42. doi: 10.3390/polym8020042.

5. Sevastianov VI, Basok YB, Kirsanova LA, Grigoriev AM, Kirillova AD, Nemets EA et al. A Comparison of the Capacity of Mesenchymal Stromal Cells for Cartilage Regeneration Depending on Collagen-Based Injectable Biomimetic Scaffold Type. Life (Basel). 2021; 11 (8):756. doi: 10.3390/life11080756. PMID: 34440500; PM-CID: PMC8400656.

6. Chang CH, Liu HC, Lin CC, Chou CH, Lin FH. Gelatinchondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 2003 Nov; 24(26): 4853–4858. doi: 10.1016/s0142-9612(03)00383-1. PMID: 14530082.

7. Yin B, Ma P, Chen J, Wang H, Wu G, Li B et al. Hybrid Macro-Porous Titanium Ornamented by Degradable 3D Gel/nHA Micro-Scaffolds for Bone Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2016; 17 (4): 575. doi: 10.3390/ijms17040575. PMID: 27092492; PMCID: PMC4849031.

8. Echave MC, Saenz del Burgo L, Pedraz JL, Orive G. Gelatin as Biomaterial for Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 2017; 23 (24): 3567–3584. doi: 10.2174/0929867324666170511123101. PMID: 28494717.

9. Kao HH, Kuo CY, Chen KS, Chen JP. Preparation of Gelatin and Gelatin/Hyaluronic Acid Cryogel Scaffolds for the 3D Culture of Mesothelial Cells and Mesothelium Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2019 Sep 12; 20 (18): 4527. doi: 10.3390/ijms20184527. PMID: 31547444; PMCID: PMC6770111.

10. Nemets EA, Belov VYu, Ilina TS, Surguchenko VA, Pankina AP, Sevastyanov VI Composite porous tubular biopolymer matrix of small diameter. Inorganic Materials: Applied Research 2019; 10 (2): 365–372. https://doi.org/10.1134/S207511331902031X.

11. Zhao P, Wang J, Li Y, Wang X, Chen C, Liu G. Microfluidic Technology for the Production of Well-Ordered Porous Polymer Scaffolds. Polymers (Basel). 2020; 12 (9): 1863. doi: 10.3390/polym12091863. PMID: 32825098; PMCID: PMC7564514.

12. Chung C, Burdick JA. Engineering cartilage tissue. Adv Drug Deliv Rev. 2008; 60 (2): 243–262. doi: 10.1016/j.addr.2007.08.027. PMID: 17976858; PMCID: PMC2230638.

13. Lutzweiler G, Ndreu Halili A, Engin Vrana N. The Overview of Porous, Bioactive Scaffolds as Instructive Biomaterials for Tissue Regeneration and Their Clinical Translation. Pharmaceutics. 2020; 12 (7): 602. doi: 10.3390/pharmaceutics12070602. PMID: 32610440; PMCID: PMC7407612.

14. Lien SM, Ko LY, Huang TJ. Effect of pore size on ECM secretion and cell growth in gelatin scaffold for articular cartilage tissue engineering. Acta Biomater. 2009; 5 (2): 670–679. doi: 10.1016/j.actbio.2008.09.020.

15. Murphy CM, Haugh MG, O’Brien FJ. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 2010; 31 (3): 461–466. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.09.063.

16. Yang J, Shi G, Bei J, Wang S, Cao Y, Shang Q et al. Fabrication and surface modification of macroporous poly(Llactic acid) and poly(L-lactic-co-glycolic acid) (70/30) cell scaffolds for human skin fibroblast cell culture. J Biomed Mater Res. 2002; 62 (3): 438–446. doi: 10.1002/jbm.10318.

17. Harley BA, Kim HD, Zaman MH, Yannas IV, Lauffenburger DA, Gibson LJ. Microarchitecture of three-dimensional scaffolds influences cell migration behavior via junction interactions. Biophys J. 2008; 95 (8): 4013–4024. doi: 10.1529/biophysj.107.122598.

18. Wartenberg A, Weisser J, Schnabelrauch M. Glycosaminoglycan-Based Cryogels as Scaffolds for Cell Cultivation and Tissue Regeneration. Molecules. 2021; 26 (18): 5597. doi: 10.3390/molecules26185597.

19. Jones LO, Williams L, Boam T, Kalmet M, Oguike C, Hatton FL. Cryogels: recent applications in 3D-bioprinting, injectable cryogels, drug delivery, and wound healing. Beilstein J Org Chem. 2021; 17: 2553–2569. doi: 10.3762/bjoc.17.171.

20. He Y, Wang C, Wang C, Xiao Y, Lin W. An Overview on Collagen and Gelatin-Based Cryogels: Fabrication, Classification, Properties and Biomedical Applications. Polymers (Basel). 2021; 13 (14): 2299. doi: 10.3390/polym13142299.

21. Savina IN, Zoughaib M, Yergeshov AA. Design and Assessment of Biodegradable Macroporous Cryogels as Advanced Tissue Engineering and Drug Carrying Materials. Gels. 2021; 7 (3): 79. doi: 10.3390/gels7030079.

22. Lozinsky VI. Cryostructuring of polymer systems. 50. Cryogels and cryotropic gel-formation: terms and definitions. Gels. 2018; 4 (3): 77. doi: 10.3390/gels4030077.

23. Lozinsky VI, Okay O. Basic principles of cryotropic gelation. Adv Polym Sci. 2014; 263: 49–101. doi: 10.1007/978-3-319-05846-7_2.

24. Лозинский ВИ, Кулакова ВК, Петренко АЮ, Петренко ЮА, Ершов АГ, Суханов ЮВ. Композиция для формирования макропористого носителя, используемого при трехмерном культивировании клеток животных или человека, и способ получения указанного носителя. Пат. РФ № 2594427 (2015); Б.И. № 23 (2016).

25. Tsvetkova AV, Vakhrushev IV, Basok YB, Grigor’ev AM, Kirsanova LA, Lupatov AY et al. Chondrogeneic Potential of MSC from Different Sources in Spheroid Culture. Bull Exp Biol Med. 2021; 170 (4): 528–536. doi: 10.1007/s10517-021-05101-x. PMID: 33725253.

26. Севастьянов ВИ, Перова НВ. Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо ® ГЕЛЬ – инъекционный биодеградируемый имплантат для заместительной и регенеративной медицины. Практическая медицина. 2014; 8 (84): 120–126.

27. Urrutia DN, Caviedes P, Mardones R, Minguell JJ, Vega-Letter AM, Jofre CM. Comparative study of the neural differentiation capacity of mesenchymal stromal cells from different tissue sources: An approach for their use in neural regeneration therapies. PLoS One. 2019; 14(3): e0213032. doi: 10.1371/journal.pone.0213032.

28. Giannasi C, Niada S, Della Morte E, Casati S, Orioli M, Gualerzi A et al. Towards Secretome Standardization: Identifying Key Ingredients of MSC-Derived Therapeutic Cocktail. Stem Cells Int. 2021; 2021: 3086122. doi: 10.1155/2021/3086122.

29. Фрешни РЯ. Культура животных клеток: практическое руководство. М.: БИНОМ, 2010. 691.

30. Chuang CH, Lin RZ, Tien HW, Chu YC, Li YC, MeleroMartin JM, et.al. Enzymatic regulation of functional vascular networks using gelatin hydrogels. Acta Biomater. 2015; 19: 85–99. doi: 10.1016/j.actbio.2015.02.024. PMID: 25749296; PMCID: PMC4589259.

31. Blache U, Guerrero J, Güven S, Klar AS, Scherberich A. Microvascular networks and models: in vitro formation. In: W. Holnthoner, A. Banfi, J. Kirkpatrick, H. Redl, eds. Vascularization for tissue engineering and regenerative medicine. Reference series in biomedical engineering. Springer, Cham. 2021: 345–383. https://doi.org/10.1007/978-3-319-54586-8.