Дедифференцировка зрелых крысиных гепатоцитов в длительно пролиферирующие печеночные прогениторные клетки.

Цель: получить длительно пролиферирующие клетки, обладающие признаками прогениторных, за счет дедифференцировки зрелых крысиных гепатоцитов с помощью комбинаций малых молекул.

Материалы и методы. Гепатоциты, выделенные из крысиной печени путем перфузии, культивировали в присутствии набора из трех малых молекул: агониста Wnt сигнального пути (CHIR99021), ингибиторов TGF-β (A83-01) и ROCK киназы (Y27632). С помощью флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии в процессе культивирования клеток оценивали морфологические характеристики и особенности роста культуры. Пролиферативную активность клеток анализировали с помощью цейтраферной съемки в режиме реального времени. Экспрессию поверхностных и внутриклеточных маркеров анализировали, используя проточную цитофлуориметрию и флуоресцентную микроскопию высокого разрешения.

Результаты. Используя комплекс малых молекул Y-27632, A-83-01 и CHIR99021, из зрелых крысиных гепатоцитов были получены длительно пролиферирующие клетки, которые экспрессировали маркеры прогениторных клеток, такие как α-фетопротеин и HNF4α. Клетки имели гепатоцитоподобную морфологию и формировали дискретные кластеры пролиферирующих клеток, образующих в процессе культивирования единый клеточный пласт. Удаление из среды малых молекул приводило к экспансии фибробластоподобных клеток и к элиминации потенциально прогениторных гепатоцитоподобных клеток.

Заключение. Подтверждена возможность получения пролиферирующих прогениторных клеток с помощью дедифференцировки зрелых гепатоцитов.

1. Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 1969; 43: 506–520. doi: 10.1083/jcb.43.3.506. PMID: 4900611.

2. Guguen-Guillouzo C, Campion JP, Brissot P, Glaise D, Launois B, Bourel M et al. High yield preparation of isolated human adult hepatocytes by enzymatic perfusion of the liver. Cell Biol Int Rep. 1982; 6: 625–628. doi: 10.1016/0309-1651(82)90187-4. PMID: 6286153.

3. Tarlow BD, Pelz C, Naugler WE, Wakefield L, Wilson EM, Finegold MJ et al. Bipotential adult liver progenitors are derived from chronically injured mature hepatocytes. Cell Stem Cell. 2014; 15: 605–618. doi: 10.1016/j.stem.2014.09.008. PMID: 25312494.

4. Afshari A, Shamdani S, Uzan G, Azarpira N. Different approaches for transformation of mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Stem Cell Res Ther. 2020; 11: 54. doi: 10.1186/s13287-020-1555-8. PMID: 32033595.

5. Kholodenko IV, Kholodenko RV, Manukyan GV, Lupatov AY, Yarygin KN. Isolation of Induced Pluripotent Cells from Stromal Liver Cells of Patients with Alcoholic Cirrhosis. Bull Exp Biol Med. 2017; 163: 535–541. doi: 10.1007/s10517-017-3845-4. PMID: 28853085.

6. Lim KT, Lee SC, Gao Y, Kim KP, Song G, An SY et al. Small Molecules Facilitate Single Factor-Mediated Hepatic Reprogramming. Cell Rep. 2016; 15: 814–829. doi: 10.1016/j.celrep.2016.03.071. PMID: 27149847.

7. Kim Y, Jeong J, Choi D. Small-molecule-mediated reprogramming: a silver lining for regenerative medicine. Exp Mol Med. 2020; 52: 213–226. doi: 10.1038/s12276-020-0383-3. PMID: 32080339.

8. Katsuda T, Kawamata M, Hagiwara K, Takahashi RU, Yamamoto Y, Camargo FD et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 2017; 20: 41–55. doi: 10.1016/j.stem.2016.10.007. PMID: 27840021.

9. Wu H, Zhou X, Fu GB, He ZY, Wu HP, You P et al. Reversible transition between hepatocytes and liver progenitors for in vitro hepatocyte expansion. Cell Res. 2017; 27: 709–712. doi: 10.1038/cr.2017.47. PMID: 28374751.

10. Fu GB, Huang WJ, Zeng M, Zhou X, Wu HP, Liu CC et al. Expansion and differentiation of human hepatocyte-derived liver progenitor-like cells and their use for the study of hepatotropic pathogens. Cell Res. 2019; 29: 8–22. doi: 10.1038/s41422-018-0103-x. PMID: 30361550.

11. Kim Y, Kang K, Lee SB, Seo D, Yoon S, Kim SJ et al. Small molecule-mediated reprogramming of human hepatocytes into bipotent progenitor cells. J Hepatol. 2019; 70: 97–107. doi: 10.1016/j.jhep.2018.09.007. PMID: 30240598.

12. Hee Hong D, Lee C, Kim Y, Lee SB, Han SC, Kim SJ et al. Generation of Hepatic Progenitor Cells from the Primary Hepatocytes of Nonhuman Primates Using Small Molecules. Tissue Eng Regen Med. 2021; 18: 305–313. doi: 10.1007/s13770-020-00327-8. PMID: 33591557.

13. Kholodenko IV, Kalinovsky DV, Svirshchevskaya EV, Doronin II, Konovalova MV, Kibardin AV et al. Multimerization through Pegylation Improves Pharmacokinetic Properties of scFv Fragments of GD2-Specific Antibodies. Molecules. 2019; 24: 3835. doi: 10.3390/molecules24213835. PMID: 31653037

14. Zhang S, Lin YH, Tarlow B, Zhu H. The origins and functions of hepatic polyploidy. Cell Cycle. 2019; 18: 1302– 1315. doi: 10.1080/15384101.2019.1618123. PMID: 31096847.

15. Katsuda T, Hosaka K, Matsuzaki J, Usuba W, PrietoVila M, Yamaguchi T et al. Transcriptomic Dissection of Hepatocyte Heterogeneity: Linking Ploidy, Zonation, and Stem/Progenitor Cell Characteristics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2020; 9: 161–183. doi: 10.1016/j.jcmgh.2019.08.011. PMID: 31493546.

16. Togarrati PP, Dinglasan N, Desai S, Ryan WR, Muench MO. CD29 is highly expressed on epithelial, myoepithelial, and mesenchymal stromal cells of human salivary glands. Oral Dis. 2018; 24: 561–572. doi: 10.1111/odi.12812. PMID: 29197149.

17. Kholodenko IV, Kurbatov LK, Kholodenko RV, Manukyan GV, Yarygin KN. Mesenchymal Stem Cells in the Adult Human Liver: Hype or Hope? Cells. 2019; 8: 1127. doi: 10.3390/cells8101127. PMID: 31546729.

18. Zou W, Zhao J, Li Y, Wang Z, Yan H, Liu Y et al. Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote the Migration and Invasion of Colorectal Cancer Stem Cells. Onco Targets Ther. 2020; 13: 6617–6628. doi: 10.2147/OTT.S249353.

19. Terry C, Hughes RD, Mitry RR, Lehec SC, Dhawan A. Cryopreservation-induced nonattachment of human hepatocytes: role of adhesion molecules. Cell Transplant. 2007; 16: 639–647. doi: 10.3727/000000007783465000. PMID: 17912955.

20. Turner RA, Mendel G, Wauthier E, Barbier C, Reid LM. Hyaluronan-supplemented buffers preserve adhesion mechanisms facilitating cryopreservation of human hepatic stem/progenitor cells. Cell Transplant. 2012; 21: 2257–2266. doi: 10.3727/096368912X637000. PMID: 22472355.

21. Masuzaki R, Ray KC, Roland J, Zent R, Lee YA, Karp SJ. Integrin β1 Establishes Liver Microstructure and Modulates Transforming Growth Factor β during Liver Development and Regeneration. Am J Pathol. 2021; 191: 309–319. doi: 10.1016/j.ajpath.2020.10.011. PMID: 33159885.

22. Sasaki K, Murakami T, Kawasaki M, Takahashi M. The cell cycle associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol. 1987; 133: 579–584. doi: 10.1002/jcp.1041330321. PMID: 3121642.

23. Chougule P. Sumitran-Holgersson S. Cytokeratins of the liver and intestine epithelial cells during development and disease. in: Hamilton G. Cytokeratins – Tools in Oncology. InTech, 2012; 118–158.

24. Masson NM, Currie IS, Terrace JD, Garden OJ, Parks RW, Ross JA. Hepatic progenitor cells in human fetal liver express the oval cell marker Thy-1. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006; 291: G45–54. doi: 10.1152/ajpgi.00465.2005. PMID: 16769813.

25. Walesky C, Apte U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 2015; 16: 101–108. doi: 10.3727/105221615X14181438 356292. PMID: 25700366.

26. Hayhurst GP, Lee YH, Lambert G, Ward JM, Gonzalez FJ. Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis. Mol Cell Biol. 2001; 21: 1393–1403. doi: 10.1128/MCB.21.4.1393-1403.2001. PMID: 11158324.

27. Inoue Y, Yu AM, Inoue J, Gonzalez FJ. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha is a central regulator of bile acid conjugation. Journal of Biological Chemistry. 2004; 279: 2480–2489. doi: 10.1074/jbc.M311015200. PMID: 14583614.

28. Inoue Y, Peters LL, Yim SH, Inoue J, Gonzalez FJ. Role of hepatocyte nuclear factor 4 alpha in control of blood coagulation factor gene expression. Journal of Molecular Medicine – Jmm. 2006; 84: 334–344. doi: 10.1007/s00109-005-0013-5. PMID: 16389552.

29. Gordillo M, Evans T, Gouon-Evans V. Orchestrating liver development. Development. 2015; 142: 2094–2108. doi: 10.1242/dev.114215. PMID: 26081571.

30. Li K, Zhang H, Wang Y, Wang Y, Feng M. Differential expression of HNF4alpha isoforms in liver stem cells and hepatocytes. J Cell Biochem. 2006; 99: 558–564. doi: 10.1002/jcb.20939. PMID: 16639723.

31. Khamzina L, Borgeat P. Correlation of alpha-fetoprotein expression in normal hepatocytes during development with tyrosine phosphorylation and insulin receptor expression. Mol Biol Cell. 1998; 9: 1093–1105. doi: 10.1091/mbc.9.5.1093. PMID: 9571242.

32. Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells. Hepatology. 2004; 39: 1477–1487. doi: 10.1002/hep.20214. PMID: 15185286.

33. Giri S, Acikgöz A, Bader A. Isolation and Expansion of Hepatic Stem-like Cells from a Healthy Rat Liver and their Efficient Hepatic Differentiation of under Welldefined Vivo Hepatic like Microenvironment in a Multiwell Bioreactor. J Clin Exp Hepatol. 2015; 5: 107–122. doi: 10.1016/j.jceh.2015.03.003. PMID: 26155038.