Сравнительный анализ протоколов децеллюляризации лентикулярной ткани роговицы

Введение. Актуальной проблемой офтальмологии является дефицит донорских роговиц. Данный факт обусловливает поиск новых альтернативных путей для лечения патологий роговицы. Технологии децеллюляризации позволяют создавать роговичные тканеинженерные конструкции, которые могут решить проблему нехватки донорских роговиц.

Цель. Провести сравнительный анализ эффективных методов обработки роговичной лентикулы и создать оптимизированный и стандартизированный протокол децеллюляризации.

Материалы и методы. Для исследования были выбраны стромальные роговичные лентикулы, полученные после операции ReLEx SMILE. Параметры лентикул: толщина 77–120 мкм, диаметр 6,5 мм. Для обработки лентикулы использовали 3 протокола: 1) обработка 1,5 М хлоридом натрия с нуклеазами (NaCl); 2) 0,1% SDS (SDS); 3) обработка раствором Трипсин-ЭДТА с последующем двойным отмыванием в гипотоническом трис-буферном растворе с нуклеазами (Трипсин-ЭДТА). Оптические свойства лентикул определяли спектрофотометрически, где в качестве контроля служили образцы до децеллюляризации. Определение структуры стромы роговичной лентикулы после децеллюляризации происходило с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и альциановым синим. Также в качестве дополнительного метода оценки состояния внеклеточного матрикса, а именно коллагена I, III, V и VI типов, проводили иммуногистохимический анализ криосрезов нативных обработанных лентикул. Флуоресцентная визуализация ядерного материла в исходных криосрезах производилась с помощью красителя Hoechst. Состояние ультраструктуры коллагеновых волокон оценивалось с помощью сканирующего электронного микроскопирования. Производили анализ количественного содержания ДНК в свежих лентикулах и в лентикулах после обработки.

Результаты. Все три протокола децеллюляризации эффективно удаляют ядерный и клеточный материал, остаточное содержание ДНК было < 50 нг/мг. Однако протокол с Трипсин-ЭДТА приводит к значительному повреждению структуры внеклеточного матрикса, что отрицательно сказывается на прозрачности роговичных тканеинженерных конструкций. Прозрачность образцов для протокола NaCl была приближена к нативным лентикулам.

Заключение. Для создания роговичной тканеинженерной конструкции протокол децеллюляризации NaCl представляется оптимизированным и может применяться для лечения различных патологий роговицы.

1. Ganesh S, Brar S, Arra RR. Refractive lenticule extraction small incision lenticule extraction: A new refractive surgery paradigm. Indian J Ophthalmol. 2018; 66 (1): 10–19. doi: 10.4103/ijo.IJO_761_17. PMID: 29283117.

2. Angunawela RI, Riau AK, Chaurasia SS, Tan DT, Mehta JS. Refractive lenticule re-implantation after myopic ReLEx: a feasibility study of stromal restoration after refractive surgery in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012; 53 (8): 4975–4985. doi: 10.1167/iovs.12-10170. PMID: 22743323.

3. Riau AK, Angunawela RI, Chaurasia SS, Lee WS, Tan DT, Mehta JS. Reversible femtosecond laser-assisted myopia correction: a non-human primate study of lenticule re-implantation after refractive lenticule extraction. PLoS One. 2013; 8 (6): e67058. doi: 10.1371/journal.pone.0067058. PMID: 23826194.

4. Pradhan KR, Reinstein DZ, Carp GI, Archer TJ, Gobbe M, Gurung R. Femtosecond laser-assisted keyhole endokeratophakia: correction of hyperopia by implantation of an allogeneic lenticule obtained by SMILE from a myopic donor. J Refract Surg. 2013; 29 (11): 777–782. doi: 10.3928/1081597X-20131021-07. PMID: 24203809.

5. Sun L, Yao P, Li M, Shen Y, Zhao J, Zhou X. The Safety and Predictability of Implanting Autologous Lenticule Obtained by SMILE for Hyperopia. J Refract Surg. 2015; 31 (6): 374–379. doi: 10.3928/1081597X-20150521-03. PMID: 26046703.

6. Ganesh S, Brar S, Rao PA. Cryopreservation of extracted corneal lenticules after small incision lenticule extraction for potential use in human subjects. Cornea. 2014; 33 (12): 1355–1362. doi: 10.1097/ICO.0000000000000276. PMID: 25343698.

7. Bonvillain RW, Danchuk S, Sullivan DE, Betancourt AM, Semon JA, Eagle ME et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 2012; 18 (23–24): 2437–2452. doi: 10.1089/ten.TEA.2011.0594. PMID: 22764775.

8. Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM, Netoff TI et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 2008; 14 (2): 213–221. doi: 10.1038/nm1684. PMID: 18193059.

9. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006; 27 (19): 3675– 3683. doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.02.014. PMID: 16519932.

10. Yam GH, Yusoff NZ, Goh TW, Setiawan M, Lee XW, Liu YC et al. Decellularization of human stromal refractive lenticules for corneal tissue engineering. Sci Rep. 2016; 6: 26339. doi: 10.1038/srep26339. PMID: 27210519.

11. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Bioma terials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057. PMID: 21296410.

12. Yin H, Qiu P, Wu F, Zhang W, Teng W, Qin Z et al. Construction of a Corneal Stromal Equivalent with SMILEDerived Lenticules and Fibrin Glue. Sci Rep. 2016; 6: 33848. doi: 10.1038/srep33848. PMID: 27651001.

13. Shafiq MA, Gemeinhart RA, Yue BY, Djalilian AR. Decellularized human cornea for reconstructing the corneal epithelium and anterior stroma. Tissue Eng Part C Methods. 2012; 18 (5): 340–348. doi: 10.1089/ten. TEC.2011.0072. PMID: 22082039.

14. Huh MI, Lee KP, Kim J, Yi S, Park BU, Kim HK. Generation of Femtosecond Laser-Cut Decellularized Corneal Lenticule Using Hypotonic Trypsin-EDTA Solution for Corneal Tissue Engineering. J Ophthalmol. 2018; 2018: 2590536. doi: 10.1155/2018/2590536. PMID: 29805794.

15. Badylak SF, Freytes DO, Gilbert TW. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 2009; 5 (1): 1–13. doi: 10.1016/j.actbio.2008.09.013. PMID: 18938117.

16. Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018; 19 (12): 4117. doi: 10.3390/ijms19124117. PMID: 30567407.

17. DelMonte DW, Kim T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 2011; 37 (3): 588–598. doi: 10.1016/j.jcrs.2010.12.037. PMID: 21333881.

18. Oh JY, Kim MK, Lee HJ, Ko JH, Wee WR, Lee JH. Processing porcine cornea for biomedical applications. Tissue Eng Part C Methods. 2009; 15 (4): 635–645. doi: 10.1089/ten.TEC.2009.0022. PMID: 19249963.