Культивирование клеток эпителия слизистой губы человека для аутологичной трансплантации при двустороннем синдроме лимбальной недостаточности роговицы

Цель. Постановка методики культивирования эксплантов и апробация упрощенной рецептуры культуральных сред для получения устойчивой популяции эпителия слизистой губы человека без фидерных клеток. Материалы и методы. Образцы слизистой губы были получены от 6 пациентов в условиях операционной после подписания информированного добровольного согласия. Экспланты для культивирования выделяли с помощью микрохирургической техники, отделяя подслизистую часть перед слоем эпителия. Культивирование проводили в базовых средах DMEM/F12 (1:1) (1,05 мМ кальция) и EpiLife (0,06 мМ кальция) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотика-антимикотика, инсулина 5 мкг/мл, гидрокортизона 5 мкг/мл и эпидермального фактора роста 10 нг/мл. Клетки нулевого пассажа окрашивали на маркеры стволовости и пролиферации (p63), промежуточных филаментов (виментин) и белка плотных межклеточных контактов тип 1 (ZO-1). Анализ изображений проводили в программе Fiji (ImageJ). Результаты. Первичная культура клеток эпителия слизистой губы была получена от всех доноров в обоих группах. Морфология клеток в культурах соответствовала классическому, по типу «булыжной мостовой». При культивировании в среде с 1,05 мМ кальция определялось 34,7% клеток (медиана, n = 3), экспрессирующих маркер p63, а длина участков экспрессии белка ZO-1 составила 17,05 мкм на клетку по медиане (n = 3). В культуре клеток в среде с 0,06 мМ кальция положительная экспрессия маркера p63 составила 39,2% (медиана, n = 3), а длина участков экспрессии белка ZO-1 была определена как 5,18 мкм на клетку по медиане (n = 3). Заключение. В настоящей работе представлен подробный протокол получения культуры клеток эпителия слизистой губы человека с высокой пролиферативной активностью из малого биоптата без фидерного слоя. Рецептура среды с 1,05 мМ кальция активирует образование плотных межклеточных контактов, и может быть использована при моделирования дифференцировки эпителия in vitro. Рецептура среды с 0,06 мМ кальция, напротив, поддерживает сниженный уровень созревающих клеток в культуре. Таким образом, рецептура культуральных сред, источник и способ культивирования клеток, описанные в данном исследовании, могут являться основой для трансплантации аутологичного клеточного конструкта клеток эпителия слизистой губы у пациентов с двусторонним синдромом лимбальной недостаточности.

1. Афанасьева Ю.И., Юрина Н.А. Гистология. М.: Медицина, 2002. 146. Afanasieva YuI, Yurina NA. Gistologia. M.: Medicina, 2002. 146.

2. Dua HS, Azuara-Blanco A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Surv Ophthalmol. 2000; 44: 415– 425. PMID: 10734241.

3. Davanger M, Evensen A. Role of the pericorneal psapillary Structure in renewal of corneal epithelium. Nature. 1971; 229 (5286): 560–561. https://doi. org/10.1038/229560a0.

4. Shortt AJ, Secker GA, Munro PM, Khaw PT, Tuft SJ, Daniels JT. Characterization of the limbal epithelial stem cell niche: novel imaging techniques permit in vivo observation and targeted biopsy of limbal epithelial stem cells. Stem Cells. 2007; 25: 1402–1409. https://doi. org/10.1634/stemcells.2006-0580.

5. Dua HS, Saini JS, Azuara-Blanco A, Gupta P. Limbal stem cell deficiency: concept, aetiology, clinical presentation, diagnosis and management. Indian J Ophthalmol. 2000; 48 (2): 83–92. PMID: 11116520.

6. Sacchetti M, Lambiase A, Cortes M, Sgrulletta R, Bonini S, Merlo D et al. Clinical and cytological findings in limbal stem cell deficiency. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2005; 243 (9): 870–876. https://doi.org/10.1007/ s00417-005-1159-0.

7. Deng SX, Borderie V, Chan CC, Dana R, Figueiredo FC, Gomes JAP et al. Global Consensus on Definition, Classification, Diagnosis, and Staging of Limbal Stem Cell Deficiency. Cornea. 2019; 38 (3): 364–375. https://doi. org/10.1097/ICO.0000000000001820.

8. Holland EJ, Mogilishetty G, Skeens HM, Hair DB, Neff KD, Biber JM et al. Systemic immunosuppression in ocular surface stem cell transplantation: results of a 10-year experience. Cornea. 2012; 31 (6): 655–661. https://doi.org/10.1097/ICO.0b013e31823f8b0c.

9. Utheim TP. Concise review: transplantation of cultured oral mucosal epithelial cells for treating limbal stem cell deficiency-current status and future perspectives. Stem Cells. 2015; 33: 1685–1695. https://doi.org/10.1002/ stem.1999.

10. Nishida K, Yamato M, Hayashida Y, Watanabe K, Yamamoto K, Adachi E et al. Corneal reconstruction with tissue engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. New Engl J Med. 2004; 351: 1187– 1196. https://doi.org/10.1056/NEJMoa040455.

11. Nakamura T, Inatomi T, Sotozono C, Amemiya T, Kanamura N, Kinoshita S. Transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial cells in patients with severe ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 2004; 88: 1280–1284. https://doi.org/10.1136/bjo.2003.038497.

12. Быков ВЛ. Гистология и эмбриональное развитие органов полости рта человека. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014: 391–393. B’ykov VL. Gistologiya i ehmbrional’noe razvitie organov polosti rta cheloveka. M.: GEOTARMedia, 2014: 391–393. [In Rus].

13. Chentsova EV, Konyushko OI, Makarov MS, Egorova NS, Zinov’ev MY, Borovkova NV. Optimization of the Method of Buccal Epithelial Cell Isolation and Culturing on Collagen Substrate for Ophthalmologic Application. Bull Exp Biol Med. 2015; 159: 168–172. https://doi. org/10.1007/s10517-015-2915-8.

14. Utheim TP, Utheim OA, Khan QE, Sehic A. Culture of Oral Mucosal Epithelial Cells for the Purpose of Treating Limbal Stem Cell Deficiency. J Funct Biomater. 2016; 7: 123. https://doi.org/10.3390/jfb7010005.

15. Фрешни РЯ. Культура животных клеток. Практическое руководство. М.: Бином, 2011. 427. Freshney RI. Animal cell culture: a practical approach. M.: Binom, 2011. 427. [In Rus].

16. Kolli S, Ahmad S, Mudhar HS, Meeny A, Lako M, Figueiredo FC. Successful application of ex vivo expanded human autologous oral mucosal epithelium for the treatment of total bilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 2014; 32 (8): 2135–2146. https://doi.org/10.1002/stem.1694.

17. Formanek M, Millesi W, Willheim M, Scheiner O, Kornfehl J. Optimized growth medium for primary culture of human oral keratinocytes. Int J Oral Maxillofac Surg. 1996; 25 (2): 157–160. PMID: 8727592.

18. Boyce ST, Ham RG. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 1983; 81 (1 Suppl): 33s–40s. https://doi. org/10.1111/1523-1747.ep12540422.

19. Technical Resources – Media Formulations. EpiLife® Medium without calcium. Available from: https://www. thermofisher.com/ru/ru/home/technical-resources/media-formulation.276.html.

20. Wang JS, Xie HT, Zhang M.C. Characterization of ex vivo Expanded Oral Mucosal Epithelium Cells on Acellular Porcine Corneal Stroma for Ocular Surface Reconstruction. J Ophthalmol. 2017; 67: 614–617. https://doi. org/10.1155/2017/676171.

21. Santibanez N. Immuno expression of E-cadherin and Vimentin in Normal Oral Mucosa, Oral Epithelial Displasiaand Oral Squamous Cell Carcinoma. Int J Morphol. 2017; 35: 596–602. PMID: 26045832.

22. Nakamura T, Endo K, Kinoshita S. Identification of human oral keratinocytes stem/progenitor cells by neurotrophin receptor p75 and the role of neurotrophin/p75 signaling. Stem cells. 2007; 25: 628–638. https://doi. org/10.1634/stemcells.2006-0494.

23. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012 28; 9 (7): 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.

24. Food and Drug Administration, HHS. Current good tissue practice for human cell, tissue, and cellular and tissue-based product establishments; inspection and enforcement. Final rule. Fed Regist. 2004; 69: 68611– 68688. PMID: 15562555.

25. Oie Y, Hayashi R, Takagi R, Yamato M, Takayanagi H, Tano Y et al. A novel method of culturing human oral mucosal epithelial cell sheet using post-mitotic human dermal fibroblast feeder cells and modified keratinocyte culture medium for ocular surface reconstruction. Br J Ophthalmol. 2010; 94 (9): 1244–1250. https://doi. org/10.1136/bjo.2009.175042.

26. Pieper FR, Van de Klundert FA, Raats JM, Henderik JB, Schaart G, Ramaekers FC et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 1992; 210 (2): 509–519. PMID: 1459133.

27. Squier С, Brogden KA. Human Oral Mucosa: Development, Structure, and Function. John Wiley & Sons, Inc.; 2011, 23.