Оценка адгезии, пролиферации и жизнеспособности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, культивируемых на поверхности биодеградируемых нетканых матриксов, модифицированных RGD-пептидами

Тканевая инженерия является многообещающим направлением для изготовления сосудистых графтов малого диаметра. В последние годы разработан ряд стратегий для придания полимерным поверхностям сосудистых протезов способности селективно адгезировать эндотелиальные клетки. Перспективной для модифицирования является последовательность аргинин–глицин–аспарагиновая кислота (RGD) – сайт клеточной адгезии, присутствующий на многих белках внеклеточного матрикса. На эффективность прикрепления эндотелиальных клеток может влиять как структура RGD-пептида, так и протяженность линкерной группы.

Цель – определить оптимальный способ модифицирования RGD-пептидами нетканых матриксов из полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона (P HBV/PCL), повышающий адгезию, жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток.

Материалы и методы. Методом электроспиннинга изготовлены трубчатые полимерные матриксы диаметром 4 мм из PHBV/PCL. Для модифицирования поверхности полимерных каркасов использовали 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиа-мин, гексаметилендиамин, глутаровый альдегид, нингидрин, аскорбиновую кислоту, циклический пептид c[RGDFK], RGDK, AhRGD. Качество проведенной модификации оценивали с помощью нингидринового теста и посредством определения аргинин-содержащего пептида. Структуру поверхности матриксов до и после модифицирования изучали методом сканирующей электронной микроскопии. Исследование адгезии, жизнеспособности и пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), культивируемых в течение 7 суток на поверхности матриксов с и без RGD, изучали с помощью флуоресцентной и сканирующей лазерной микроскопии после предварительного окрашивания клеток флуоресцентными ядерными красителями этидиумом бромидом и Hoechst 33342, а также набором на пролиферацию ClickiTTM Plus EdU Alexa FluorTM 488 Imaging Kit.

Результаты. Большей биодоступностью и активностью обладали RGD-пептиды, связанные с поверхностью матриксов посредством длинного линкера (4,7,10-три-окса-1,13-тридекандиамин). Высокая клеточная адгезия, жизнеспособность и пролиферация отмечены на поверхности матриксов, модифицированных RGDK и c[RGDFK], тогда как их парные аналоги с коротким линкером (гексаметилендиамин) демонстрировали низкие результаты клеточной жизнеспособности даже на фоне удовлетворительной клеточной адгезии.

Заключение. Нетканые матриксы на основе PHBV/PCL,  модифицирование поверхности которых проведено с использованием 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиами-на, демонстрировали лучшие результаты в плане адгезии HUVEC и последующего сохранения клеточной жизнеспособности и пролиферации, а RGD-содержащие пептиды RGDK и c[RGDFK] были более тропны к рецепторам эндотелиальных клеток.

1. Taggart DP. Current status of arterial grafts for coronary artery bypass grafting. Ann Cardiothorac Surg. 2013; 2 (4): 427–430.

2. Ren X, Feng Y, Guo J, Wang K, Li Q, Yang J et al. Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications. Chem Soc Rev. 2015; 44 (15): 5680–5742.

3. Wang F, Li Y, Shen Y, Wang A, Wang S, Xie T. The functions and applications of RGD in tumor therapy and tissue engineering. Int J Mol Sci. 2013; 14 (7): 13447– 13462.

4. Harburger DS, Calderwood DA. Integrinsignalling at a glance. J Cell Sci. 2009; (122): 159–163.

5. Gabriel M, van NieuwAmerongen GP, van Hinsbergh VW, Amerongen AV, Zentner A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J Biomater Sci Polym Ed. 2006; 17 (5): 567–577.

6. Gabriel M, Nazmi K, Dahm M, Zentner A, Vahl CF, Strand D. Covalent RGD modification of the inner pore surface of polycaprolactone scaffolds. J Biomater Sci Polym Ed. 2012; 23 (7): 941–953.

7. Hersel U, Dahmen C, Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 2003; 24 (24): 4385–4415.

8. Houseman BT, Mrksich M. The microenvironment of immobilized Arg-Gly-Asp peptides is an important determinant of cell adhesion. Biomaterials. 2001; 22 (9): 943–955.

9. Lee JW, Park YJ, Lee SJ, Lee SK, Lee KY. The effect of spacer arm length of an adhesion ligand coupled to an alginate gel on the control of fibroblast phenotype. Biomaterials. 2010; 31: 5545–5551.

10. Santiago LY, Nowak RW, Rubin JP, Marra KG. Peptidesurface modification of poly(caprolactone) with lamininderived sequences for adipose-derived stem cell applications. Biomaterials. 2006; 27: 2962–2969.

11. Lin HB, Sun W, Mosher DF, Garciaecheverria C, Schaufelberger K, Lelkes PI, Cooper SL. Synthesis, surface, and celladhesion properties of polyurethanes containing covalently grafted RGD-peptides. J Biomed Mater Res. 1994; 28: 329–342.

12. Parniak MA, Lange G, Viswanatha T. Quantitative determination of monosubstituted guanidines: a comparative study of different procedures. J Biochem Biophys Methods. 1983; 7: 267–276.

13. Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, Minick CR. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. Clin Invest. 1973; 52: 2745–2756.