Методика выделения жизнеспособных островков Лангерганса из фрагмента хвостовой части поджелудочной железы человека

Введение. Современные методы тканевой инженерии в лечении ряда дегенеративных заболеваний позволяют надеяться на перспективность биомедицинских технологий, основанных на создании эквивалента поврежденной ткани (органа), в том числе тканеинженерной конструкции (ТИК) эндокринного отдела поджелудочной железы (ПЖ). Получение жизнеспособных островков Лангерганса (ОЛ) из поджелудочной железы является определяющим шагом на пути создания ТИК ПЖ. Классическая методика выделения ОЛ базируется на ферментативном переваривании панкреатической ткани и дальнейшей очистке островков в градиенте плотности фиколла при центрифугировании, что неблагоприятно сказывается на морфофункциональном состоянии ОЛ.

Цель работы состояла в разработке методики выделения жизнеспособных панкреатических островков из фрагмента хвостовой части ПЖ человека с учетом сроков холодовой ишемии органа.

Материалы и методы. Опробована методика выделения ОЛ без применения перфузии коллагеназой ткани ПЖ в камере Рикорди на стадии выделения ОЛ и без фиколла с разным градиентом плотности на стадии очистки ОЛ. Идентификацию полученных ОЛ проводили с помощью окрашивания дитизоном. Жизнеспособность ОЛ определяли с помощью набора LIVE/DEAD ® Cell Viability Kit. Гистологическое исследование исходного материала включало рутинные методы окрашивания, а также иммуногистохимическое окрашивание основных типов островковых клеток.

Результаты. Морфологическое исследование фрагментов ПЖ на разных сроках холодовой ишемии не обнаружило существенных различий гистологической картины паренхимы органа; островковый аппарат при этом выглядел сохранным. Прижизненное окрашивание подтверждает жизнеспособность выделенных ОЛ in vitro, по меньшей мере, в течение 1–3 суток.

Заключение. Предложенный способ дал возможность сократить количество стадий обработки панкреатической ткани человека, тем самым минимизировать неблагоприятное воздействие центрифугирования и фиколла на сохранность ОЛ. Из небольшого фрагмента ПЖ человека на сроках холодовой ишемии до 19 ч удается получить необходимое количество жизнеспособных ОЛ, которые могут быть использованы при создании ТИК поджелудочной железы.

1. Mao AS, Mooney DJ. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. PNAS. 2015; 112 (47): 14452–14459. doi: 10.1073/pnas.1508520112.

2. Barton FB, Rickels MR, Alejandro R, Hering BJ, Wease S, Naziruddin B et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999–2010. Diabetes Care. 2012 Jul; 35 (7): 1436–1445. doi: 10.2337/dc12-0063.

3. Matsumoto S. Islet cell transplantation for type 1 diabetes. J Diabetes. 2010 Mar; 2 (1): 16–22. doi: 10.1111/j.1753-0407.2009.00048.x.

4. Van Bell TL, Coppieters KT, von Herrath MG. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 2011 Jan; 91 (1): 79–118. doi: 10.1152/physrev.00003.2010.

5. Gan MJ, Albanese­O’Neill A, Haller MJ. Type 1 diabetes: current concepts in epidemiology, pathophysiology, clinical care, and research. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 2012 Nov-Dec; 42 (10): 269–291. doi: 10.1016/j.cppeds.2012.07.002.

6. Ehlers MR. Strategies for clinical trials in type 1 diabetes. J Autoimmun. 2016 Jul; 71: 88–96. doi: 10.1016/j.jaut2016.03.008.

7. Ziegler M, Ziegler B. Immunological disorders of type 1 diabetes mellitus. Exp Clin Endocrinol. 1989 Sep; 94 (1–2): 97–114.

8. Wahren J., Larsson C. C-peptide: new findings and therapeutic possibilities. Diabetes Res Clin Pract. 2015 Mar; 107 (3): 309–319. doi: 10.1016/j.diabres.2015.01.016.

9. Kiriyama Y, Nochi H. Role and cytotoxicity of amylin and protection of pancreatic islet β-cells from amylin cytotoxicity. Cells. 2018 Aug 6; 7 (8). pii: E95. doi: 10.3390/cells7080095.

10. Bottino R, Knoll MF, Knoll CA, Bertera S, Trucco MM. The future of islet transplantation is now. Front Med (Lausanne). 2018 Jul 13; 5: 202. doi: 10.3389/fmed.2018.00202.

11. Jamiolkowski RM, Guo LY, Li YR, Shaffer SM, Naji A, Yale J. Islet transplantation in type 1 diabetes mellitus. Yale J Biol Med. 2012 Mar; 85 (1): 37–43.

12. Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C.Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017 May; 13 (5): 268–277. doi: 10.1038/nrendo.2016.178.

13. Maffi P, Secchi A.Clinical results of islet transplantation. Pharmacol Res. 2015 Aug; 98: 86–91. doi: 10.1016/jphrs.2015.04.010.

14. Merani S, Shapiro AM. Current status of pancreatic islet transplantation. Clin Sci(Lond). 2006 Jun; 110 (6): 611–625.

15. Amer LD, Mahoney MJ, Bryant SJ. Tissue engineering approaches to cell-based type 1 diabetes therapy. Tissue engineering. 2014; Part B, 20 (5): 455–467. doi: 10.1089/ten.TEB.2013.0462.

16. Pileggi A, Fenjves ES, Klein D, Ricordi C, Pastori RL. Protecting pancreatic beta-cells. IUBMB Life. 2004 Jul; 56 (7): 387–394.

17. Timofeev AV. A cell-population structure of the pancreas and the use of cellular technology in the treatment of diabetes. Stem cell biology and cellular technologies. 2009; 2: 253–310.

18. Kelly C, Mc Clenaghan NH, Flatt PR. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 2011 Mar-Apr; 3 (2): 41–47.

19. Ricordi C, Hering BJ, Shapiro AM. Beta-cell transplantation for diabetes therapy. Lancet. 2008 Jul 5; 372 (9632): 27–28. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60984-8.

20. Matsumoto S, Noguchi H, Yonekawa Y, Okitsu T, Iwanaga Y, Liu X et al. Pancreatic islet transplantation for treating diabetes. Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan; 6 (1): 23–37.

21. Paget M, Murray H, Bailey CJ, Downing R. Human islet isolation: semi-automated and manual methods. Diabetes & Vascular Disease Research. 2007; 4: 7–12. doi: 10.3132/dvdr.2007.010.

22. Min T, Yi L, Chao Z, Haitao Z, Wei W, Liang Y et al. Superiority of visipaque (iodixanol) – controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification. Transplant Proc. 2010 Jun; 42 (5): 1825–1829. doi: 10.1016/j.transproceed.2010.01.068.