Влияние трипсина на биохимические и функциональные свойства децеллюляризованного суставного хряща свиньи

Цель работы: исследовать влияние включения в протокол децеллюляризации суставного хряща свиньи стадии предобработки его трипсином на способность к восстановлению биохимического состава и функциональных свойств полученной мелкодисперсной тканеспецифической матрицы при сокультивировании с мезенхимными стромальными клетками жировой ткани человека (МСК ЖТч).

Материалы и методы. Суставной хрящ свиньи микронизировали до размеров не более 250 мкм. Полученные микрочастицы суставного хряща свиньи (МХс) обрабатывали раствором трипсина (0,05; 0,25; 0,50%) / ЭДТА при +37 °С в течение 24 часов. Далее МХс последовательно инкубировали в течение 24 часов в трех растворах поверхностно-активных веществ, содержащих 0,1% додецилсульфат натрия и повышающуюся концентрацию Triton Х-100 (1, 2, 3%), при комнатной температуре и в растворе ДНКазы I типа при +37 °C в течение 48 часов. Затем оценивали степень изменения биохимического состава и способность децеллюляризованных МХс (ДМХс) матриц в составе клеточно-инженерных конструкций (КИК) поддерживать адгезию МСК ЖТч, их пролиферацию, а также потенциальную способность оказывать стимулирующее регенерационное воздействие. В ДМХс и КИК исследовали содержание ДНК, гликозаминогликанов (ГАГ) и коллагена. Морфологию образцов исследовали с использованием гистологического и иммуногистохимического окрашивания.

Результаты исследования. Гистологический анализ показал отсутствие клеток и детрита в образцах ДМХс. При предварительной обработке МХс раствором с наименьшим содержанием трипсина (0,05%) / ЭДТА в образцах сохранилось 5,14 ± 0,87 нг/мг ДНК, при этом снизилось содержание ГАГ до 5,34 ± 0,9 мкг/мг и коллагена до 154 ± 34 мкг/мг. К 28-м суткам культивирования КИК выявлена наработка адгезированными клетками собственного внеклеточного матрикса (ВКМ), содержащего ГАГ и коллаген. Количество ДНК в нем составляло 6,30 ± 0,11 мкг/КИК, а количество ГАГ 19,36 ± 0,73 мкг/ КИК.

Заключение. Предобработка трипсином позволяет достичь равномерной полной децеллюляризации МХс. Вместе с тем наступившие изменения состава ВКМ свидетельствуют о снижении способности МСК ЖТч в процессе сокультивирования с ДМХс синтезировать ГАГ и коллаген II типа. Увеличение пролиферативной активности адгезированных МСК ЖТч, а также тканеспецифичность ДМХс-матрицы позволят продолжить исследования в направлении создания гидрогелевой формы матрикса, способной повысить специфический и стимулирующий регенераторный потенциал в процессе сокультивирования с клетками того же фенотипа.

1. Cramer MC, Badylak SF. Extracellular matrix-based biomaterials and their influence upon cell behavior. Annals of Biomedical Engineering. 2020; 48 (7): 2132–2153. doi: 10.1007/s10439-019-02408-9. PMID: 31741227.

2. Jambar Nooshin B, Tayebi T, Babajani A, Khani MM, Niknejad H. Effects of different perfusing routes through the portal vein, hepatic vein, and biliary duct on whole rat liver decellularization. Cell journal. 2023; 25 (1): 35–44. doi: 10.22074/cellj.2022.557600.1081. PMID: 36680482.

3. Hsu CY, Chi PL, Chen HY, Ou SH, Chou KJ, Fang HC et al. Kidney bioengineering by using decellularized kidney scaffold and renal progenitor cells. Tissue and Cell. 2022; 74: 101699. doi: 10.1016/j.tice.2021.101699. PMID: 34891081.

4. Tang-Quan KR, Mehta NA, Sampaio LC, Taylor DA. Whole cardiac tissue bioscaffolds. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2018; 1098: 85–114. doi: 10.1007/978-3-319-97421-7_5. PMID: 30238367.

5. Bölükbas DA, De Santis MM, Alsafadi HN, Doryab A, Wagner DE. The preparation of decellularized mouse lung matrix scaffolds for analysis of lung regenerative cell potential. Methods in Molecular Biology. 2019; 1940: 275–295. doi: 10.1007/978-1-4939-9086-3_20. PMID: 30788833.

6. Berger C, Bjørlykke Y, Hahn L, Mühlemann M, Kress S, Walles H et al. Matrix decoded – a pancreatic extracellular matrix with organ specific cues guiding human ipsc differentiation. Biomaterials. 2020; 244: 119766. doi: 10.1016/j.biomaterials.2020.119766. PMID: 32199284.

7. Khajavi M, Hashemi M, Kalalinia F. Recent advances in optimization of liver decellularization procedures used for liver regeneration. Life Sciences. 2021; 281: 119801. doi: 10.1016/j.lfs.2021.119801. PMID: 34229008.

8. Sevastianov VI, Ponomareva AS, Baranova NV, Kirsanova LA, Basok YB, Nemets EA et al. Decellularization of human pancreatic fragments with pronounced signs of structural changes. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24 (1): 119. doi: 10.3390/ijms24010119. PMID: 36613557.

9. Qian H, He L, Ye Z, Wei Z, Ao J. Decellularized matrix for repairing intervertebral disc degeneration: fabrication methods, applications and animal models. Materials Today Bio. 2022; 18: 100523. doi: 10.1016/j.mtbio.2022.100523. PMID: 36590980.

10. Басок ЮБ, Кириллова АД, Григорьев АМ, Кирсанова ЛА, Немец ЕА, Севастьянов ВИ. Получение микродисперсного тканеспецифического децеллюляризованного матрикса из суставного хряща свиньи. Перспективные материалы. 2020; 5: 51–60. doi: 10.30791/1028-978x-2020-5-51-60.

11. Немец ЕА, Лажко АЭ, Басок ЮБ, Кирсанова ЛА, Кириллова АД, Севастьянов ВИ. Особенности получения тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного хряща свиньи. Сверхкритические флюиды: теория и практика. 2020; 15 (2): 3–13. doi: 10.34984/SCFTP.2020.15.2.001.

12. Keane TJ, Swinehart IT, Badylak SF. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 2015; 84: 25–34. doi: 10.1016/j.ymeth.2015.03.005. PMID: 25791470.

13. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057. PMID: 21296410.

14. Gilpin A, Yang Y. Decellularization strategies for regenerative medicine: from processing techniques to applications. BioMed Research International. 2017; 2017: 9831534. doi: 10.1155/2017/9831534. PMID: 28540307.

15. Gailit J, Ruoslahti E. Regulation of the fibronectin receptor affinity by divalent cations. Journal of Biological Chemistry. 1988; 263 (26): 12927–12932. doi: 10.1016/s0021-9258(18)37650-6. PMID: 2458338.

16. Maurer P, Hohenester E. Structural and functional aspects of calcium binding in extracellular matrix proteins. Matrix Biology. 1997; 15 (8–9): 569–580. doi: 10.1016/S0945-053X(97)90033-0. PMID: 9138289.

17. Hopkinson A, Shanmuganathan VA, Gray T, Yeung AM, Lowe J, James DK et al. Optimization of amniotic membrane (am) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering – Part C: Methods. 2008; 14 (4): 371–381. doi: 10.1089/ten.tec.2008.0315. PMID: 18821842.

18. Schenke-Layland K, Vasilevski O, Opitz F, König K, Riemann I, Halbhuber KJ et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 2003; 143 (3): 201–208. doi: 10.1016/j.jsb.2003.08.002. PMID: 14572475.

19. Waldrop FS, Puchtler H, Meloan SN, Younker TD. Histochemical investigations of different types of collagen. Acta histochemica Supplementband. 1980; 21: 21–31. PMID: 6808564.

20. Lin CH, Kao YC, Ma H, Tsay RY. An investigation on the correlation between the mechanical property change and the alterations in composition and microstructure of a porcine vascular tissue underwent trypsin-based decellularization treatment. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2018; 86: 199–207. doi: 10.1016/j.jmbbm.2018.06.029. PMID: 29986294.

21. Grauss RW, Hazekamp MG, Oppenhuizen F, Van Munsteren CJ, Gittenberger-De Groot AC, DeRuiter MC. Histological evaluation of decellularised porcine aortic valves: matrix changes due to different decellularisation methods. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 2005; 27 (4): 566–571. doi: 10.1016/j.ejcts.2004.12.052. PMID: 15784352.

22. Merna N, Robertson C, La A, George SC. Optical imaging predicts mechanical properties during decellularization of cardiac tissue. Tissue Engineering – Part C: Methods. 2013; 19 (10): 802–809. doi: 10.1089/ten.tec.2012.0720. PMID: 23469868.

23. Giraldo-Gomez DM, García-López SJ, Tamay-de-Dios L, Sánchez-Sánchez R, Villalba-Caloca J, Sotres-Vega A et al. Fast cyclical-decellularized trachea as a natural 3d scaffold for organ engineering. Materials Science and Engineering C. 2019; 105: 110142. doi: 10.1016/j.msec.2019.110142. PMID: 31546345.

24. Rahman S, Griffin M, Naik A, Szarko M, Butler PEM. Optimising the decellularization of human elastic cartilage with trypsin for future use in ear reconstruction. Scientific Reports. 2018; 8 (1): 3097. doi: 10.1038/s41598-018-20592-x. PMID: 29449572.

25. Vernice NA, Berri N, Bender RJ, Dong X, Spector JA. Production of a low-cost, off-the-shelf, decellularized cartilage xenograft for tissue regeneration. Annals of Plastic Surgery. 2022; 88 (3): S296–S301. doi: 10.1097/SAP.0000000000003185. PMID: 35513335.

26. Дмитриева ЕГ, Хацко СЛ, Якимов АА. Способ гистологической окраски артерий сердца. Сибирский научный медицинский журнал. 2022; 42 (3): 47–51. doi: 10.18699/SSMJ20220305.

27. Gilbert T, Sellaro T, Badylak S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006; 27 (19): 3675– 3683. doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.02.014. PMID: 16519932.

28. Sevastianov VI, Basok YB, Grigoriev AM, Nemets EA, Kirillova AD, Kirsanova LA et al. Decellularization of cartilage microparticles: effects of temperature, supercritical carbon dioxide and ultrasound on biochemical, mechanical, and biological properties. Journal of Biomedical Materials Research – Part A. 2023; 111 (4): 543–555. doi: 10.1002/jbm.a.37474. PMID: 36478378.

29. Семенычева ЛЛ, Егорихина МН, Часова ВО, Валетова НБ, Митин АВ, Кузнецова ЮЛ. Эффективность протеаз панкреатина и трипсина при ферментативном гидролизе коллагена. Вестник ЮУрГУ. Серия «Химия». 2020; 12 (1): 66–75. doi: 10.14529/chem200108.

30. Tsvetkova AV, Vakhrushev IV, Basok YB, Grigor’ev AM, Kirsanova LA, Lupatov AY et al. Chondrogeneic potential of msc from different sources in spheroid culture. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2021; 170 (4): 528–536. doi: 10.1007/s10517-021-05101-x. PMID: 33725253.

31. Ghassemi T, Saghatoleslami N, Mahdavi-Shahri N, Matin MM, Gheshlaghi R, Moradi A. A comparison study of different decellularization treatments on bovine articular cartilage. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2019; 13 (10): 1861–1871. doi: 10.1002/term.2936. PMID: 31314950.

32. Lin S, He Y, Tao M, Wang A, Ao Q. Fabrication and evaluation of an optimized xenogenic decellularized costal cartilage graft: preclinical studies of a novel biocompatible prosthesis for rhinoplasty. Regenerative Biomaterials. 2021; 8 (6): rbab052. doi: 10.1093/rb/rbab052.

33. Giraldo-Gomez DM, Leon-Mancilla B, Del Prado-Audelo ML, Sotres-Vega A, Villalba-Caloca J, Garciadiego-Cazares D et al. Trypsin as enhancement in cyclical tracheal decellularization: morphological and biophysical characterization. Materials Science and Engineering C. 2016. doi: 10.1016/j.msec.2015.10.094. PMID: 26652450.

34. Perea-Gil I, Uriarte JJ, Prat-Vidal C, Gálvez-Montón C, Roura S, Llucià-Valldeperas A et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 2015; 7 (3): 558–573. PMID: 26045895.

35. Басок ЮБ, Севастьянов ВИ. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины в лечении дефектов хрящевой ткани суставов. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2016; 18 (4): 102–122. doi: 10.15825/1995-1191- 2016-4-102-122.

36. Sevastianov VI, Basok YuB, Kirsanova LA, Grigoriev AM, Kirillova AD, Nemets EA et al. A comparison of the capacity of mesenchymal stromal cells for cartilage regeneration depending on collagen-based injectable biomimetic scaffold type. Life. 2021; 11 (8): 756. doi: 10.3390/life11080756.