Сравнительное исследование хондрогенеза мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека при культивировании на коллагенсодержащих носителях в условиях in vitro

По способу получения коллагеновые носители подразделяются на материалы, полученные на основе компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), в частности, коллагенсодержащие гидрогели и децеллюляризованные ткани.

Цель работы: сравнить in vitro способность биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля (БМКГ) и тканеспецифического матрикса из децеллюляризованного суставного хряща свиньи (ДХ) поддерживать адгезию, пролиферацию и хондрогенную дифференцировку мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч).

Материалы и методы. Для децеллюляризации хряща использовали обработку поверхностно-активными веществами (додецилсульфат натрия, Тритон Х-100) с последующей экспозицией в ДНКазе. Оценку метаболической активности МСК ЖТч проводили методом окрашивания PrestoBlue™ (Invitrogen, США). Морфологическое исследование клеточно-инженерных конструкций (КИК), формирующихся при культивировании МСК ЖТч в присутствии матриксов, проводили с использованием методов гистологического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с лантаноидным контрастированием.

Результаты. Количество клеток на поверхности как БМКГ, так и ДХ увеличивалось в течение 14 дней. Митохондриальная активность клеток на 3, 10 и 14-е сутки при культивировании на ДХ была выше в 1,7; 1,7 и 1,3 раза по сравнению с БМКГ соответственно. На 14-е сутки культивирования в хондрогенной культуральной среде МСК ЖТч образовали клеточные пласты на поверхности ДХ и на поверхности БМКГ. Цитоплазма клеток включала многочисленные гранулы, по окраске напоминающие сам матрикс. На поверхности матрикса ДХ клетки распределялись более равномерно, тогда как в случае БМКГ адгезия и пролиферация клеток наблюдались только на отдельных участках. При этом наработанный клетками ВКМ содержал коллаген и гликозаминогликаны (ГАГ).

Заключение. Способность полученного по разработанному протоколу ДХ образовывать с МСК ЖТч КИК с равномерным распределением клеток и наработкой ими специфичного ВКМ, содержащего коллаген и ГАГ, свидетельствует о потенциале ДХ в регенерации поврежденного хряща. Хондрогенную дифференцировку МСК ЖТч наблюдали как при культивировании с БМКГ, так и с ДХ. При создании тканевого эквивалента хряща in vitro следует учитывать преимущество применения тканеспецифического матрикса по сравнению с БМКГ.

1. Kwon H, Brown WE, Lee CA, Wang D, Paschos N, Hu JC et al. Surgical and tissue engineering strategies for articular cartilage and meniscus repair. Nat Rev Rheumatol. 2019; 15 (9): 550–570. doi: 10.1038/s41584-019-0255-1. PMID: 31296933.

2. Bernhard JC, Vunjak-Novakovic G. Should we use cells, biomaterials, or tissue engineering for cartilage regeneration? Stem Cell Res Ther. 2016; 7 (1): 56. doi: 10.1186/s13287-016-0314-3. PMID: 27089917.

3. Schneider S, Unger M, van Griensven M, Balmayor ER. Adipose-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine. Eur J Med Res. 2017; 22 (1): 17. doi: 10.1186/s40001-017-0258-9. PMID: 28526089.

4. Tsvetkova AV, Vakhrushev IV, Basok YB, Grigor’ev AM, Kirsanova LA, Lupatov AY et al. Chondrogeneic potential of MSC from different sources in spheroid culture. Bull Exp Biol Med. 2021; 170 (4): 528–536. doi: 10.1007/s10517-021-05101-x. PMID: 33725253.

5. Rai V, Dilisio MF, Dietz NE, Agrawal DK. Recent strategies in cartilage repair: A systemic review of the scaffold development and tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2017; 105 (8): 2343–2354. doi: 10.1002/jbm.a.36087. PMID: 28387995.

6. Wylie JD, Hartley MK, Kapron AL, Aoki SK, Maak TG. What is the effect of matrices on cartilage repair? Clin Orthop Relat Res. 2015; 473 (5): 1673–1682. doi: 10.1007/s11999-015-4141-0. PMID: 25604876.

7. Севастьянов ВИ, Перова НВ. Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ – инъекционный биодеградируемый имплантат для заместительной и регенеративной медицины. Практическая медицина. 2014; 8 (84): 120–126.

8. Sevastianov VI, Basok YB, Grigor’ev AM, Kirsanova LA, Vasilets VN. Formation of tissue-engineered construct of human cartilage tissue in a flow-through bioreactor. Bull Exp Biol Med. 2017; 164 (2): 269–273. doi: 10.1007/s10517-017-3971-z. PMID: 29177908.

9. Cramer MC, Badylak SF. Extracellular matrix-based biomaterials and their influence upon cell behavior. Ann Biomed Eng. 2020; 48 (7): 2132–2153. doi: 10.1007/s10439-019-02408-9. PMID: 31741227.

10. Basok YuB, Kirillova AD, Grigoryev AM, Kirsanova LA, Nemets EA, and Sevastianov VI. Fabrication of microdispersed tissue-specific decellularized matrix from porcine articular cartilage. Inorganic Materials: Applied Research. 2020; 11 (5). 1153–1159.

11. Sun Y, Yan L, Chen S, Pei M. Functionality of decellularized matrix in cartilage regeneration: A comparison of tissue versus cell sources. Acta Biomater. 2018; 74: 56–73. doi: 10.1016/j.actbio.2018.04.048. PMID: 29702288.

12. Pei M, Li JT, Shoukry M, Zhang Y. A review of decellularized stem cell matrix: a novel cell expansion system for cartilage tissue engineering. Eur Cell Mater. 2011; 22: 333–343. doi: 10.22203/ecm.v022a25. PMID: 22116651.

13. Севастьянов ВИ, Перова НВ, Басок ЮБ, Немец ЕА. Биомиметики внеклеточного матрикса в тканевой инженерии и регенеративной медицине для травматологии и ортопедии. Opinion Leader. 2020; 6 (35): 35–46.

14. Tsvetkova AV, Vakhrushev IV, Basok YB, Grigor’ev AM, Kirsanova LA, Lupatov AY et al. Chondrogeneic Potential of MSC from Different Sources in Spheroid Culture. Bull Exp Biol Med. 170 (4): 528–536. doi: 10.1007/s10517-021-05101-x. Epub 2021 Mar 16. PMID: 33725253.

15. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8 (4): 315–317. doi: 10.1080/14653240600855905. PMID: 16923606.

16. Novikov I, Subbot A, Turenok A, Mayanskiy N, Chebotar I. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride. Micron. 2019; 124: 102687. doi: 10.1016/j.micron.2019.102687. PMID: 31302532.

17. Иксанова АГ, Бондарь ОВ, Балакин КВ. Методы исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов. Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по курсу «Методы скрининга физиологически активных веществ». Казань: Казанский университет, 2016. 40.

18. Bourguignon LY, Singleton PA, Zhu H, Zhou B. Hyaluronan promotes signaling interaction between CD44 and the transforming growth factor beta receptor I in metastatic breast tumor cells. J Biol Chem. 2002; 277 (42): 39703–39712. doi: 10.1074/jbc.M204320200. PMID: 12145287.

19. Responte DJ, Natoli RM, Athanasiou KA. Identification of potential biophysical and molecular signalling mechanisms underlying hyaluronic acid enhancement of cartilage formation. J R Soc Interface. 2012; 9 (77): 3564– 3573. doi: 10.1098/rsif.2012.0399. PMID: 22809846.

20. Nehrer S, Breinan HA, Ramappa A, Shortkroff S, Young G, Minas T et al. Canine chondrocytes seeded in type I and type II collagen implants investigated in vitro. J Biomed Mater Res. 1997; 38 (2): 95–104. doi: 10.1002/(sici)1097-4636(199722)38:23.0.co;2-b. PMID: 9178736.

21. Tiruvannamalai Annamalai R, Mertz DR, Daley EL, Stegemann JP. Collagen Type II enhances chondrogenic differentiation in agarose-based modular microtissues. Cytotherapy. 2016; 18 (2): 263–277. doi: 10.1016/j.jcyt.2015.10.015. PMID: 26794716.