Микроносители в виде волокон из натурального шелка для культивирования клеток

Разработка эффективных и универсальных микроносителей является актуальной задачей тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Цель данной работы – создание биосовместимых микрочастиц в виде волокон из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, изучение их структуры и биологических свойств.

Материалы и методы. Для получения микрочастиц отмытые от серицина коконы тутового шелкопряда Bombyx mori подвергали криоизмельчению в жидком азоте. Анализ структуры полученных микрочастиц осуществляли методом сканирующей электронной микроскопии. Оценку цитотоксичности полученных волокон проводили методом МТТ с использованием культуры клеток мышиных фибробластов 3Т3. Анализ  адгезии клеток проводили с использованием линии клеток гепатокарциномы человека Hep-G2, визуализацию клеток осуществляли путем окрашивания ядер  флуоресцентным красителем DAPI.

Результаты. Были получены микрочастицы из натурального шелка в виде цилиндрических волокон со средней длиной 200–400 мкм и диаметром 15 мкм. Показано, что поверхность полученных микрочастиц имеет шероховатый рельеф, пор  обнаружено не было. Микрочастицы являются не токсичными для клеток мышиных фибробластов 3Т3, поддерживают высокий уровень адгезии клеток гепатокарциномы человека Hep-G2.

Заключение. Разработанная нами методика получения биосовместимых микрочастиц из фиброина шелка в виде волокон без использования токсичных  реагентов и значительных временных затрат является перспективной для культивирования клеток и доставки клеток в область повреждения для восстановления тканей и органов.

1. Asghar W, El Assal R, Shafiee H, Pitteri S, Paulmurugan R, Demirci U. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Mater Today (Kidlington). 2015; 18 (10): 539–553. doi: 10.1016/j.mattod.2015.05.002. PMID: 28458612.

2. In JG, Foulke-Abel J, Estes MK, Zachos NC, Kovbasnjuk O, Donowitz M. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016; 13 (11): 633–642. doi: 10.1038/nrgastro.2016.142. PMID: 27677718.

3. Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Threedimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 2014; 12 (4): 207–218. doi: 10.1089/adt.2014.573. PMID: 24831787.

4. Skardal A, Devarasetty M, Rodman C, Atala A, Soker S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. 2015; 43 (10): 2361–2373. doi: 10.1007/s10439-015-1298-3. PMID: 25777294.

5. Bao J, Shi Y, Sun H, Yin X, Yang R, Li L et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplant. 2011; 20 (5): 753–766. doi: 10.3727/096368910X536572.

6. Soto-Gutierrez A, Zhang L, Medberry C, Fukumitsu K, Faulk D, Jiang H et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng Part C Methods. 2011; 17 (6): 677–686. doi: 10.1089/ten.TEC.2010.0698. PMID: 21375407.

7. Zhou P, Lessa N, Estrada DC, Severson EB, Lingala S, Zern MA et al. Decellularized liver matrix as a carrier for the transplantation of human fetal and primary hepatocytes in mice. Liver Transpl. 2011; 17 (4): 418–427. doi: 10.1002/lt.22270. PMID: 21445925.

8. Pampaloni F, Reynaud EG, Stelzer EH. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8 (10): 839–845. doi: 10.1038/nrm2236. PMID: 17684528.

9. Achilli TM, Meyer J, Morgan JR. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin Biol Ther. 2012; 12 (10): 1347–1360. doi: 10.1517/14712598.2012.707181. PMID: 22784238.

10. Chen AK, Reuveny S, Oh SK. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 2013; 31 (7): 1032–1046. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.03.006. PMID: 23531528.

11. Quittet MS, Touzani O, Sindji L, Cayon J, Fillesoye F, Toutain J et al. Effects of mesenchymal stem cell therapy, in association with pharmacologically active microcarriers releasing VEGF, in an ischaemic stroke model in the rat. Acta Biomater. 2015; 15: 77–88. doi: 10.1016/j.actbio.2014.12.017. PMID: 25556361.

12. Georgi N, van Blitterswijk C, Karperien M. Mesenchymal stromal/stem cell-or chondrocyte-seeded microcarriers as building blocks for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A. 2014; 20 (17–18): 2513–2523. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0681. PMID: 24621188.

13. Yang Y, Rossi FM, Putnins EE. Ex vivo expansion of rat bone marrow mesenchymal stromal cells on microcarrier beads in spin culture. Biomaterials. 2007; 28 (20): 3110–3120. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.03.015. PMID: 17433434.

14. Chen M, Wang X, Ye Z, Zhang Y, Zhou Y, Tan WS. A modular approach to the engineering of a centimetersized bone tissue construct with human amniotic mesenchymal stem cells-laden microcarriers. Biomaterials. 2011; 32 (30): 7532–7542. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.06.054. PMID: 21774980.

15. Zhou Y, Yan Z, Zhang H, Lu W, Liu S, Huang X et al. Expansion and delivery of adipose-derived mesenchymal stem cells on three microcarriers for soft tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 2011; 17 (23–24): 2981–2997. doi: 10.1089/ten.tea.2010.0707. PMID: 21875329.

16. Sun LY, Hsieh DK, Syu WS, Li YS, Chiu HT, Chiou TW. Cell proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells on biodegradable microcarriers enhances in vitro differentiation potential. Cell Prolif. 2010; 43 (5): 445–456. doi: 10.1111/j.1365-2184.2010.00694.x. PMID: 20887551.

17. Agapov II, Moisenovich MM, Vasilyeva TV, Pustovalova OL, Kon’kov AS, Arkhipova AY et al. Biodegradable matrices from regenerated silk of Bombix mori. Dokl Biochem Biophys. 2010; 433: 201–204. doi: 10.1134/S1607672910040149.

18. Uebersax L, Merkle HP, Meinel L. Insulin-like growth factor I releasing silk fibroin scaffolds induce chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Control Release. 2008; 127 (1): 12–21. doi: 10.1016/j.jconrel.2007.11.006. PMID: 18280603.

19. Altman AM, Gupta V, Ríos CN, Alt EU, Mathur AB. Adhesion, migration and mechanics of human adiposetissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 2010; 6 (4): 1388–1397. doi: 10.1016/j.actbio.2009.10.034. PMID: 19861180.

20. Kotliarova MS, Zhuikov VA, Chudinova YV Khaidapova DD, Moisenovich AM, Kon’kov AS et al. Induction of osteogenic differentiation of osteoblast-like cells MG-63 during cultivation on fibroin microcarriers. Moscow Univ Biol Sci Bull. 2016; 71: 212–217. doi: 10.3103/S0096392516040052.

21. Luetchford KA, Chaudhuri JB, De Bank PA. Silk fibroin/gelatin microcarriers as scaffolds for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020; 106: 110116. doi: 10.1016/j.msec.2019.110116. PMID: 31753329.

22. Moisenovich MM, Plotnikov EY, Moysenovich AM, Silachev DN, Danilina TI, Savchenko ES et al. Effect of Silk Fibroin on Neuroregeneration After Traumatic Brain Injury. Neurochem Res. 2019; 44 (10): 2261–2272. doi: 10.1007/s11064-018-2691-8. PMID: 30519983.

23. Perteghella S, Martella E, de Girolamo L, Perucca Orfei C, Pierini M, Fumagalli V et al. Fabrication of Innovative Silk/Alginate Microcarriers for Mesenchymal Stem Cell Delivery and Tissue Regeneration. Int J Mol Sci. 2017; 18 (9): 1829. doi: 10.3390/ijms18091829. PMID: 28832547.

24. Агапов ИИ, Агапова ОИ, Боброва ММ, Сафонова ЛА, Ефимов АЕ. Микроноситель для клеток на основе натурального шелка и способ его получения. Патент на изобретение RU2732598 С1, 21.09.2020.

25. ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». М.: Стандартинформ, 2014.

26. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983; 65 (1–2): 55–63. doi: 10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID: 6606682.

27. Kundu B, Rajkhowa R, Kundu SC, Wang X. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65 (4): 457–470. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.043. PMID: 23137786.

28. Zhang Q, Zhao Y, Yan S, Yang Y, Zhao H, Li M et al. Preparation of uniaxial multichannel silk fibroin scaffolds for guiding primary neurons. Acta Biomater. 2012; 8 (7): 2628–2638. doi: 10.1016/j.actbio.2012.03.033. PMID: 22465574.

29. Сафонова ЛА, Боброва ММ, Агапова ОИ, Котлярова МС, Архипова АЮ, Мойсенович ММ, Агапов ИИ. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка. Современные технологии в медицине. 2015; 7 (3): 6–13. doi: 10.17691/stm2015.7.3.01.

30. Сургученко ВА, Пономарева АС, Ефимов АЕ, Немец ЕА, Агапов ИИ, Севастьянов ВИ. Особенности адгезии и пролиферации фибробластов мыши линии nih/3т3 на пленках из бактериального сополимера поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерата) с различной шероховатостью поверхности. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012; 14 (1): 72–77. doi: 10.15825/1995-1191-2012-1-72-77.

31. Servoli E, Maniglio D, Motta A, Predazzer R, Migliaresi C. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts. Macromol Biosci. 2005; 5 (12): 1175–1183. doi: 10.1002/mabi.200500137. PMID: 16315185.

32. Соколова АИ, Боброва ММ, Сафонова ЛА, Агапова ОИ, Мойсенович ММ, Агапов ИИ. Зависимость биологических свойств скаффолдов из фиброина шелка и желатина от состава и технологии изготовления. Современные технологии в медицине. 2016; 8 (3): 6–15. doi: 10.17691/stm2016.8.3.01.