Preview

Вестник трансплантологии и искусственных органов

Расширенный поиск

Экспериментальные подходы к созданию тканеспецифического матрикса для биоискусственной печени

https://doi.org/10.15825/1995-1191-2020-3-123-133

Полный текст:

Аннотация

Дефицит донорских органов для трансплантации печени при лечении терминальных стадий печеночной недостаточности диктует необходимость разработки альтернативных методов, к которым относятся технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины. Целью работы было исследование способности тканеспецифического матрикса из децеллюляризованных фрагментов печени человека (ДФПч) поддерживать адгезию и пролиферацию мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) и HepG2 в статических условиях и в проточном биореакторе. Материалы и методы. Для децеллюляризации фрагментов (не более 8 мм3) печени человека использовали обработку поверхностноактивными веществами (ПАВ) – додецилсульфатом натрия, Тритоном Х-100 с последующей экспозицией в ДНКазе. Биохимические исследования включали определение количества ДНК в исследуемых образцах. Эффективность отмывки от ПАВ оценивали по цитотоксичности матрикса на культуре фибробластов NIH 3T3. Оценку жизнеспособности и метаболической активности клеток проводили методом прижизненного окрашивания комплексом флюоресцентных красителей LIVE/DEAD ® и PrestoBlue™ (Invitrogen, США). Морфологическое исследование клеточно-инженерных конструкций печени проводили с использованием методов гистологического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием. Результаты. Показано, что использованная методика децеллюляризации печени позволяет получать биосовместимый матрикс с остаточным количеством ДНК менее 1%, способный поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2. В биореакторе на 7-е сутки культивирования наблюдали образование единого конгломерата матрикса ДФПч с многочисленными группами жизнеспособных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Содержание мочевины в культуральной среде превышает значение для образцов, полученных в статических условиях, и составляет 1,5 ± 0,1 ммоль/л, что свидетельствует о метаболической активности HepG2 в составе полученных культуральных систем. Показано, что постоянный поток культуральной среды перфузионного биореактора способствовал росту пролиферативой активности HepG2 и позволил обеспечить более равномерную колонизацию клетками матрикса по сравнению со статическими условиями культивирования. Заключение. Найдены условия равномерного заселения ДФПч в проточном биореакторе клеточными культурами. Способность матрикса поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2 в течение 11 суток свидетельствует о возможности его использования в тканевой инженерии печени.

Об авторах

А. М. Григорьев
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Григорьев Алексей Михайлович.

Адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1. 

Тел. (499) 193-86-62. 



Ю. Б. Басок
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



А. Д. Кириллова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



Л. А. Кирсанова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



Н. П. Шмерко
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



А. М. Суббот
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»
Россия

Москва



Е. А. Немец
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



И. А. Милосердов
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)
Россия

Москва



М. Ю. Шагидулин
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)
Россия

Москва



В. И. Севастьянов
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России
Россия

Москва



Список литературы

1. Croce S, Peloso A, Zoro T, Avanzini MA, Cobianchi L. A hepatic scaffold from decellularized liver tissue: food for thought. Biomolecules. 2019; 9 (12): 813. doi: 10.3390/biom9120813. PMID: 31810291.

2. Yang W, Xia R, Zhang Y, Zhang H, Bai L. Decellularized liver scaffold for liver regeneration. Methods Mol Biol. 2018; 1577: 11–23. doi: 10.1007/7651_2017_53. PMID: 28856614.

3. Bilodeau C, Goltsis O, Rogers IM, Post M. Limitations of recellularized biological scaffolds for human transplantation. J Tissue Eng Regen Med. 2020; 14 (3): 521–538. doi: 10.1002/term.3004. PMID: 31826325.

4. Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: a systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 2018; 19 (12): 4117. doi: 10.3390/ijms19124117. PMID: 30567407.

5. Ahmed E, Saleh T, Yu L, Kwak HH, Kim BM, Park KM et al. Micro and ultrastructural changes monitoring during decellularization for the generation of a biocompatible liver. J Biosci Bioeng. 2019; 128 (2): 218–225. doi: 10.1016/j.jbiosc.2019.02.007. PMID: 3090445.

6. Willemse J, Verstegen MMA, Vermeulen A, Schurink IJ, Roest HP, van der Laan LJW et al. Fast, robust and effective decellularization of whole human livers using mild detergents and pressure controlled perfusion. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020; 108: 110200. doi: 10.1016/j.msec.2019.110200. PMID: 31923991.

7. Butter A, Aliyev K, Hillebrandt KH, Raschzok N, Kluge M, Seiffert N et al. Evolution of graft morphology and function after recellularization of decellularized rat livers. J Tissue Eng Regen Med. 2018; 12 (2): e807–e816. doi: 10.1002/term.2383. PMID: 27957815.

8. Naeem EM, Sajad D, Talaei-Khozani T, Khajeh S, Azarpira N, Alaei S et al. Decellularized liver transplant could be recellularized in rat partial hepatectomy model. J Biomed Mater Res A. 2019; 107 (11): 2576–2588. doi: 10.1002/jbm.a.36763. PMID: 31361939.

9. Готье СВ, Севастьянов ВИ, Шагидулин МЮ, Немец ЕА, Басок ЮБ. Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения. Патент на изобретение RU 2693432 C2, 02.07.2019.

10. Elchaninov A, Fatkhudinov T, Usman N, Arutyunyan I, Makarov A, Lokhonina A et al. Multipotent stromal cells stimulate liver regeneration by influencing the macrophage polarization in rat. World J Hepatol. 2018 Feb 27; 10 (2): 287–296.; Zhou Q, Li L, Li J. Stem cells with decellularized liver scaffolds in liver regeneration and their potential clinical applications. Liver Int. 2015 Mar; 35 (3): 687–694. doi: 10.1111/liv.12581.

11. Shimoda H, Yagi H, Higashi H, Tajima K, Kuroda K, Abe Y et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Sci Rep. 2019; 9 (1): 12543. doi: 10.1038/s41598-019-48948-x. PMID: 31467359.

12. Donato MT, Tolosa L, Gómez-Lechón MJ. Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells. Methods Mol Biol. 2015; 1250: 77–93. doi: 10.1007/978-1-4939-2074-7_5.

13. Sevastyanov VI, Basok YB, Grigoryev AM, Kirsanova LA, Vasilets VN. A perfusion bioreactor for making tissue-engineered constructs. Biomedical Engineering. 2017; 51 (3): 162–165.

14. ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». М.: Стандартинформ, 2014.

15. Novikov I, Subbot A, Turenok A, Mayanskiy N, Chebotar I. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride. Micron. 2019; 124: 102687. doi: 10.1016/j.micron.2019.102687. PMID: 31302532.

16. Zhang L, Guan Z, Ye J-S, Yin Y-F, Stoltz J-F, de Isla N. Research progress in liver tissue engineering. Biomed Mater Eng. 2017; 29 (s1): S113–S119.

17. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.

18. Nibourg GA, Hoekstra R, van der Hoeven TV, Ackermans MT, Hakvoort TB, van Gulik TM, Chamuleau RA. Increased hepatic functionality of the human hepatoma cell line HepaRG cultured in the AMC bioreactor. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Aug; 45 (8): 1860–1868.


Для цитирования:


Григорьев А.М., Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Кирсанова Л.А., Шмерко Н.П., Суббот А.М., Немец Е.А., Милосердов И.А., Шагидулин М.Ю., Севастьянов В.И. Экспериментальные подходы к созданию тканеспецифического матрикса для биоискусственной печени. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2020;22(3):123-133. https://doi.org/10.15825/1995-1191-2020-3-123-133

For citation:


Grigoriev A.M., Basok Yu.B., Kirillova A.D., Kirsanova L.A., Shmerko N.P., Subbot A.M., Nemets E.A., Miloserdov I.A., Shagidulin M.Yu., Sevastyanov V.I. Experimental approaches to creating a tissue-specific matrix for a bioartificial liver. Russian Journal of Transplantology and Artificial Organs. 2020;22(3):123-133. (In Russ.) https://doi.org/10.15825/1995-1191-2020-3-123-133

Просмотров: 78


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1995-1191 (Print)
ISSN 2412-6160 (Online)