Сравнительное исследование адгезии и пролиферации фибробластов линии NIH 3T3 на покрытиях из фиброина домашнего и дикого шелка и их композитах с хитозаном

Цель: оценить in vitro цитотоксичность, адгезию и пролиферацию фибробластов на пленочных покрытиях из фиброина домашнего шелка Bombyx mori, фиброина дикого шелка (Tussah) и их композитов с хитозаном. Материалы и методы. В работе исследовали четыре типа пленочных покрытий: фиброин Bombyx mori, фиброин дикого шелка, а также их композиты с хитозаном. Покрытия получали методом литья водных растворов с последующей сушкой. Цитотоксичность оценивали в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-5 методом исследования экстрактов. Адгезию фибробластов линии NIH 3T3 оценивали через 1 час после засева клеток на покрытия, пролиферацию – на 1-е, 2-е и 3-и сутки. Количество клеток определяли после окрашивания ядер 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) с использованием флуоресцентной микроскопии и автоматизированного анализа изображений. В качестве групп сравнения использовали культуральный пластик с чистой средой и средой с добавлением этилендиаминтетрауксусной кислоты или диметилсульфоксида. Результаты. Все исследованные покрытия поддерживали жизнеспособность фибробластов; показатели их метаболической активности находились на уровне, сопоставимом со значениями, полученными для культурального пластика. Установлено, что адгезия и пролиферация клеток на покрытиях из фиброина дикого шелка были эффективнее по сравнению с покрытиями из фиброина Bombyx mori на всех временных точках. Введение хитозана приводило к дополнительному увеличению числа адгезированных и пролиферирующих клеток. Наибольшие значения клеточного ответа зафиксированы для композитных покрытий на основе фиброина дикого шелка и хитозана. Заключение. Пленочные покрытия на основе фиброина дикого шелка демонстрируют повышенную способность поддерживать адгезию и пролиферацию фибробластов in vitro – более чем в 2 раза выше, чем фиброин Bombyx mori с хитозаном. Композитные системы с включением хитозана дополнительно усиливают эти свойства, что делает их перспективными кандидатами для разработки функциональных биомедицинских покрытий.

1. Tremel A, Cai A, Tirtaatmadja N, Hughes BD, Stevens GW, Landman KA et al. Cell migration and proliferation during monolayer formation and wound healing. Chem Eng Sci. 2009; 64: 247–253. doi: 10.1016/j.ces.2008.10.008.

2. Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 2002; 110 (6): 673–687. doi: 10.1016/S0092-8674(02)00971-6.

3. Parsons JT, Horwitz AR, Schwartz MA. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11: 633–643. doi: 10.1038/nrm2957.

4. Murphy WL, McDevitt TC, Engler AJ. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 2014; 13: 547–557. doi: 10.1038/nmat3937.

5. Altman GH, Diaz F, Jakuba C, Calabro T, Horan RL, Chen J et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 2003; 24 (3): 401–416. doi: 10.1016/S0142-9612(02)00353-8.

6. Sahoo JK, Hasturk O, Falcucci T, Kaplan DL. Silk chemistry and biomedical material designs. Nat Rev Chem. 2023; 7: 302–318. doi: 10.1038/s41570-023-00486-x.

7. Hu X, Lu Q, Kaplan DL, Cebe P. Microphase separation controlled β-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 2009; 42: 2079–2087. doi: 10.1021/ma802481p.

8. Rockwood DN, Preda RC, Yücel T, Wang X, Lovett ML, Kaplan DL. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 2011; 6 (10): 1612–1631. doi: 10.1038/nprot.2011.379.

9. Агапова ОИ, Агапов ИИ. Биодеградируемые изделия на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины. М.: Техносфера, 2018: 14–64.

10. Подболотова ЕИ, Пашутин АР, Грудинин НВ, Агапова ОИ, Ефимов АЕ, Агапов ИИ. Исследование механических и структурных свойств шелковых скаффолдов для тканевой инженерии и реконструктивной хирургии. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2025; 27 (4): 125–132. doi: 10.15825/1995-1191-2025-4-125-132.

11. Safonova L, Bobrova M, Efimov A, Lyundup A, Agapova O, Agapov I. A Comparative Analysis of the Structure and Biological Properties of Films and Microfi brous Scaffolds Based on Silk Fibroin. Pharmaceutics. 2021 Sep 26; 13 (10): 1561. doi: 10.3390/pharmaceutics13101561.

12. Pashutin A, Podbolotova E, Kirsanova L, Dosi O, Efimov AE, Agapova O, Agapov I. Silk fibroin microparticle/carboxymethyl cellulose composite gel for wound healing applications. Biomimetics. 2025; 10 (7): 434. doi: 10.3390/biomimetics10070434.

13. Minoura N, Aiba S, Gotoh Y, Tsukada M, Imai Y. Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices. J Biomed Mater Res. 1995; 29: 1215–1221. doi: 10.1002/jbm.820291008.

14. Dash M, Chiellini F, Ottenbrite RM, Chiellini E. Chitosan – a versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications. Prog Polym Sci. 2011; 36 (8): 981–1014. doi: 10.1016/j.progpolymsci.2011.02.001.

15. Ajisawa A. Dissolution of silk fibroin with calcium chloride/ethanol aqueous solution: Studies on the dissolution of silk fibroin. (IX). J Seric Sci Jpn. 1998; 67 (2): 91–94.

16. Zhang H, Li LL, Dai FY, Zhang HH, Ni B, Zhou W et al. Preparation and characterization of silk fibroin as a biomaterial with potential for drug delivery. J Transl Med. 2012, 10: 117. doi: 10.1186/1479-5876-10-117.

17. Сафонова ЛА, Боброва ММ, Агапова ОИ, Архипова АЮ, Гончаренко АВ, Агапов ИИ. Пленки на основе фиброина шелка для заживления полнослойной раны кожи у крыс. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2016; 18 (3): 74–84. doi: 10.15825/1995-1191-2016-3-74-84.

18. Partridge MA, Marcantonio EE. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Mol Biol Cell. 2006 Oct; 17 (10): 4237–4248. doi: 10.1091/mbc.e06-06-0496.

19. Keselowsky BG, Collard DM, García AJ. Surface chemistry modulates fibronectin conformation and directs integrin binding and specificity to control cell adhesion. J Biomed Mater Res A. 2003 Aug 1; 66 (2): 247–259. doi: 10.1002/jbm.a.10537. PMID: 12888994.

20. Yadav H, Malviya R, Kaushik N. Chitosan in biomedicine: A comprehensive review of recent developments. Carbohydrate Polymer Technologies and Applications. 2024; 8: 100551. doi: 10.1016/j.carpta.2024.100551.