vtioВестник трансплантологии и искусственных органовRussian Journal of Transplantology and Artificial Organs1995-1191Academician V.I.Shumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs", Ministry of Health of the Russian Federation10.15825/1995-1191-2024-2-145-155vtio-1789Research ArticleРегенеративная медицина и клеточные технологииRegenerative Medicine and Cell TechnologiesБиомиметический подход к разработке протезов кровеносных сосудов малого диаметраBiomimetic approach to the design of artificial small‑diameter blood vesselsНемецЕ. А.NemetsE. A.

Немец Евгений Абрамович

123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1

Тел. (968) 840-47-45

Evgeniy Nemets

1, Shchukinskaya str., Moscow, 123182, Russian Federation.

Phone: (968) 840-47-45

evgnemets@yandex.ruБеловВ. Ю.BelovYu. V.

Москва

Moscow

w.000000000@yandex.ruКирьяковК. С.KiryakovK. S.

Москва

Moscow

kiriakovmd@gmail.comГрудининН. В.GrudininN. V.

Москва

Moscow

zbignev.religa@mail.ruБогдановВ. К.BogdanovV. K.

Москва

Moscow

bogdanovv@bk.ruФилипповК. С.FilippovK. S.

Москва

Moscow

filippovkirill02@yandex.ruНикольскаяА. О.NikolskayaA. O.

Москва

Moscow

allanik64@yandex.ruТюняеваИ. Ю.TyunyaevaI. Yu.

Москва

Moscow

tuniasha@list.ruВыпрышкоА. А.VypryshkoA. A.

Москва

Moscow

aavypryshko@vk.comЗахаревичВ. М.ZaxarevichV. M.

Moscow

zaharslava@yandex.ruБасокЮ. Б.BasokYu. B.

Москва

Moscow

bjb2005@mail.ruСевастьяновВ. И.SevastianovV. I.

Москва

Moscow

viksev@yandex.ruФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава РоссииРоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial OrgansRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России; Автономная некоммерческая организация «Институт медико-биологических исследований и технологий»РоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs; Institute of Biomedical Research and TechnologyRussian Federation202407042024262145155Copyright © Немец Е.А., Белов В.Ю., Кирьяков К.С., Грудинин Н.В., Богданов В.К., Филиппов К.С., Никольская А.О., Тюняева И.Ю., Выпрышко А.А., Захаревич В.М., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И., 20242024Немец Е.А., Белов В.Ю., Кирьяков К.С., Грудинин Н.В., Богданов В.К., Филиппов К.С., Никольская А.О., Тюняева И.Ю., Выпрышко А.А., Захаревич В.М., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И.Nemets E.A., Belov Y.V., Kiryakov K.S., Grudinin N.V., Bogdanov V.K., Filippov K.S., Nikolskaya A.O., Tyunyaeva I.Y., Vypryshko A.A., Zaxarevich V.M., Basok Y.B., Sevastianov V.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.transpl.ru/vtio/article/view/1789Цель

Цель: разработать многослойные пористые трубчатые каркасы (ПТК) диаметром 2 мм с характеристиками, близкими к естественным кровеносным сосудам малого диаметра.

Материалы и методы

Материалы и методы. ПТК из поликапролактона (ПКЛ, ММ 80000) с водозапирающим слоем из ПКЛ с добавлением желатина (ПКЛЖ) диаметром 2 мм формировали методом электроспиннинга (NANON-01A). Биоактивное покрытие наносили на поверхность ПТК последовательной инкубацией в растворах бычьего сывороточного альбумина, гепарина (Гп) и лизата тромбоцитов (ЛТ). Цитотоксичность исследовали в условиях непосредственного контакта ПТК с монослоем фибробластов мыши линии NIH/3T3. Жизнеспособность ЭКч линии EA.hy926 оценивали с помощью набора Live/Dead® Viability/Cytotoxicity Kit. Проходимость и параметры кровотока ПТК, имплантированных в инфраренальный отдел аорты крысы, регистрировали с применением допплерографии.

Результаты

Результаты. Разработана трехслойная конструкция ПТК с внутренним диаметром 2 мм, внутренний и внешний слои которой сформированы из 0,2 мл раствора ПКЛ, а средний водозапирающий слой – из 0,5 мл раствора ПКЛ с добавлением 30% (по массе полимера) желатина. Введение водозапирающего слоя позволило снизить хирургическую пористость (ХП) с 56,2 ± 8,7 мл/(см2·мин) в случае однослойного ПТК из чистого ПКЛ до 8,9 ± 2,6 мл/(см2·мин) для трехслойного ПТК. Полученные ПТК продемонстрировали физико-механические характеристики, сходные с естественными кровеносными сосудами, а также отсутствие цитотоксичности. Нанесение биоактивного покрытия из Гп и ЛТ позволило повысить in vitro адгезию и пролиферацию ЭК. Была осуществлена коррекция техники имплантации фрагментов трехслойных ПТК длиной 10 мм в инфраренальный отдел аорты крысы, позволившая минимизировать кровопотерю и сужение области анастомозов. В остром эксперименте доказано, что протезы проходимы, а параметры кровотока (систолическая и диастолическая скорость, индекс резистивности) близки к соответствующим показателям естественной аорты крысы.

Заключение

Заключение. Разработанные трехслойные конструкции ПТК имеют низкую ХП и физико-механические свойства, близкие к нативным кровеносным сосудам. Нанесение биологически активного покрытия позволяет улучшить in vitro матриксные свойства ПТК относительно ЭКч. При кратковременной имплантации в аорту экспериментального животного ПТК продемонстрировали отсутствие раннего тромбоза, при этом параметры кровотока были близки к показателям естественной аорты крысы. Таким образом, трехслойный ПТК с биоактивным покрытием может быть использован в качестве каркаса для формирования in situ тканеинженерной конструкции кровеносного сосуда малого диаметра.

Objective

Objective: To create 2-mm diameter multilayer porous tubular scaffolds (PTS) with characteristics that resemble small-diameter native blood vessels in terms of characteristics.

Materials and methods

Materials and methods. PTS made of polycaprolactone (PCL, MM 80000) with a PCL-made sealing coat/layer with gelatin addition (PCL-gelatin) with a diameter of 2 mm were created by electrospinning (NANON-01A). Bioactive coating was applied to the PTS surface by sequential incubation in solutions of bovine serum albumin, heparin (Hp), and platelet lysate (PL). Cytotoxicity was investigated under conditions of direct contact of PTS with a monolayer of NIH/3T3 mouse fibroblasts. Viability of human umbilical vein endothelial cells (EA.hy926) was evaluated using Live/Dead® Viability/Cytotoxicity Kit. Permeability and blood flow parameters of the PTS implanted in the infrarenal section of the rat aorta were recorded using Doppler imaging.

Results

Results. A three-layer PTS construct with an inner diameter of 2 mm was developed. Its inner and outer layers were formed from 0.2 mL of PCL solution, and the middle sealing coat/layer was from 0.5 mL of PCL with addition of 30% (by weight of polymer) gelatin. Introduction of the sealing coat/layer reduced surgical porosity (SP) from 56.2 ± 8.7 mL/(cm2·min) for a single-layer PTS made of pure PCL to 8.9 ± 2.6 mL/(cm2·min) for a three-layer PTS. The resulting PTS demonstrated physicomechanical characteristics similar to those of native blood vessels; it also showed no cytotoxicity. Application of a bioactive coating of Hp and PL allowed for increased in vitro adhesion and proliferation of endothelial cells. The technique of implantation of 10 mm long fragments of three-layer PTS into the infrarenal section of a rat aorta was corrected, thus minimizing blood loss and narrowing the anastomosis site. In an acute experiment, it was proven that the prostheses were patent and that blood flow parameters (systolic and diastolic velocity, resistivity index) were close to the corresponding indicators of native rat aorta.

Conclusion

Conclusion. The developed three-layer PTS constructs have low SP and physicomechanical properties close to those of native blood vessels. Bioactive coating improves the in vitro matrix properties of PTS relative to human endothelial cells. At short-term implantation into the aorta of experimental animals, PTS showed no early thrombosis, while blood flow parameters were close to those of native rat aorta. Thus, three-layer PTS with bioactive coating can be used as a scaffold for creation of in situ tissue-engineered construct of a small-diameter blood vessel.

сосудистый протезэлектроспиннингтрубчатый пористый каркасполикапролактонжелатингепаринлизат тромбоцитовэндотелиальные клеткицитотоксичностьимплантацияаорта крысыvascular prosthesiselectrospinningtubular porous scaffoldpolycaprolactonegelatinheparinplatelet lysateendothelial cellscytotoxicityimplantationrat aortaReferencesDas D, Noh I. Overviews of Biomimetic Medical Materials. Adv Exp Med Biol. 2018; 1064: 3–24. doi: 10.1007/978-981-13-0445-3_1.Das D, Noh I. Overviews of Biomimetic Medical Materials. Adv Exp Med Biol. 2018; 1064: 3–24. doi: 10.1007/978-981-13-0445-3_1.Weekes A, Bartnikowski N, Pinto N, Jenkins J, Meinert C, Klein TJ. Biofabrication of small diameter tissueengineered vascular grafts. Acta Biomater. 2022 Jan 15; 138: 92–111. doi: 10.1016/j.actbio.2021.11.012.Weekes A, Bartnikowski N, Pinto N, Jenkins J, Meinert C, Klein TJ. Biofabrication of small diameter tissueengineered vascular grafts. Acta Biomater. 2022 Jan 15; 138: 92–111. doi: 10.1016/j.actbio.2021.11.012.Wesolowski SA, Fries CC, Karlson KE, De Bakey M, Sawyer PN. Porosity: primary determinant of ultimate fate of synthetic vascular grafts. Surgery. 1961; 50: 91–96.Wesolowski SA, Fries CC, Karlson KE, De Bakey M, Sawyer PN. Porosity: primary determinant of ultimate fate of synthetic vascular grafts. Surgery. 1961; 50: 91–96.Лебедев ЛВ, Плотник ЛЛ, Смирнов АД. Протезы кровеносных сосудов. Л.: Медицина, 1981; 192.Лебедев ЛВ, Плотник ЛЛ, Смирнов АД. Протезы кровеносных сосудов. Л.: Медицина, 1981; 192. Lebedev LV, Plotnik LL, Smirnov AD. Protezy krovenosnykh sosudov. L.: Meditsina, 1981; 192.Guan G, Yu C, Fang X, Guidoin R, King MW, Wang H, Wang L. Exploration into practical significance of integral water permeability of textile vascular grafts. J Appl Biomater Funct Mater. 2021; 22808000211014007. doi: 10.1177/22808000211014007.Guan G, Yu C, Fang X, Guidoin R, King MW, Wang H, Wang L. Exploration into practical significance of integral water permeability of textile vascular grafts. J Appl Biomater Funct Mater. 2021; 22808000211014007. doi: 10.1177/22808000211014007.Copes F, Pien N, Van Vlierberghe S, Boccafoschi F, Mantovani D. Collagen-Based Tissue Engineering Strategies for Vascular Medicine. Front Bioeng Biotechnol. 2019; 7: 166. doi: 10.3389/fbioe.2019.00166.Copes F, Pien N, Van Vlierberghe S, Boccafoschi F, Mantovani D. Collagen-Based Tissue Engineering Strategies for Vascular Medicine. Front Bioeng Biotechnol. 2019; 7: 166. doi: 10.3389/fbioe.2019.00166.Fortin W, Bouchet M, Therasse E, Maire M, Héon H, Ajji A et al. Negative In Vivo Results Despite Promising In Vitro Data With a Coated Compliant Electrospun Polyurethane Vascular Graft. J Surg Res. 2022; 279: 491– 504. doi: 10.1016/j.jss.2022.05.032.Fortin W, Bouchet M, Therasse E, Maire M, Héon H, Ajji A et al. Negative In Vivo Results Despite Promising In Vitro Data With a Coated Compliant Electrospun Polyurethane Vascular Graft. J Surg Res. 2022; 279: 491– 504. doi: 10.1016/j.jss.2022.05.032.Huang F, Sun L, Zheng J. In vitro and in vivo characterization of a silk fibroin-coated polyester vascular prosthesis. Artif Organs. 2008; 12: 932–941. doi: 10.1111/j.15251594.2008.00655.x.Huang F, Sun L, Zheng J. In vitro and in vivo characterization of a silk fibroin-coated polyester vascular prosthesis. Artif Organs. 2008; 12: 932–941. doi: 10.1111/j.15251594.2008.00655.x.Lee JH, Kim WG, Kim SS, Lee JH, Lee HB. Development and characterization of an alginate-impregnated polyester vascular graft. J Biomed Mater Res. 1997; 36: 200–208. doi: 10.1002/(sici)1097-4636(199708)36:2<200::aidjbm8>3.0.co;2-o.Lee JH, Kim WG, Kim SS, Lee JH, Lee HB. Development and characterization of an alginate-impregnated polyester vascular graft. J Biomed Mater Res. 1997; 36: 200–208. doi: 10.1002/(sici)1097-4636(199708)36:2<200::aidjbm8>3.0.co;2-o.Lisman A, Butruk B, Wasiak I, Ciach T. Dextran/Albumin hydrogel sealant for Dacron(R) vascular prosthesis. J Biomater Appl. 2014; 28: 1386–1396. doi: 10.1177/0885328213509676.Lisman A, Butruk B, Wasiak I, Ciach T. Dextran/Albumin hydrogel sealant for Dacron(R) vascular prosthesis. J Biomater Appl. 2014; 28: 1386–1396. doi: 10.1177/0885328213509676.Madhavan K, Elliott WH, Bonani W, Monnet E, Tan W. Mechanical and biocompatible characterizations of a readily available multilayer vascular graft. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013; 101: 506–519. doi: 10.1002/jbm.b.32851.Madhavan K, Elliott WH, Bonani W, Monnet E, Tan W. Mechanical and biocompatible characterizations of a readily available multilayer vascular graft. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013; 101: 506–519. doi: 10.1002/jbm.b.32851.Немец ЕА, Панкина АП, Сургученко ВА, Севастьянов ВИ. Биостабильность и цитотоксичность медицинских изделий на основе сшитых биополимеров. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2018; 20 (1): 79–85.Nemets EA, Pankina AP, Surguchenko VA, Sevastianov VI. Bistability and cytotoxicity of medical devices based on cross-linked biopolymers. Russian Journal of Transplantology and Artificial Organs. 2018; 20 (1): 79–85. (In Russ.). doi: 10.15825/1995-1191-2018-1-79-85.Глушкова ТВ, Овчаренко ЕА, Рогулина НВ, Клышников КЮ, Кудрявцева ЮА, Барбараш ЛС. Дисфункции эпоксиобработанных биопротезов клапанов сердц а. Кардиология. 2019; 59 (10): 49–59.Glushkova TV, Ovcharenko EA, Rogulina NV, Klyshnikov KYu, Kud ryavtseva YuA, Barbarash LS. Dysfunction Patterns of Epoxy-Treated Tissue Heart Valves. Kardiologiia. 2019; 59 (10): 49–59. (In Russ.). doi: 10.18087/cardio.2019.10. n327.Hennink WE, van Nostrum CF. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliv Rev. 2002; 54: 13–36. doi: 10.1016/s0169-409x(01)00240-x.Hennink WE, van Nostrum CF. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliv Rev. 2002; 54: 13–36. doi: 10.1016/s0169-409x(01)00240-x.Новикова СП, Салохединова РР, Лосева СВ, Николашина ЛН, Левкина АЮ. Анализ физико-механических и структурных характеристик протезов кровеносных сосудов. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. 2012; 54 (4): 27–33.Novikova SP, Salokhedinova RR, Loseva SV, Nikolashina LN, Levkina AYu. Analysis of physico-mechanical and structural characteristics of vascular prostheses. Grudnaya i serdechnososudistaya khirurgiya. 2012; 54 (4): 27–33.Попова ИВ, Степанова АО, Сергеевичев ДС, Акулов АЕ, Захарова ИС, Покушалов АА и др. Сравнительное исследование трех типов протезов, изготовленных методом электроспиннинга, в эксперименте in vitro и in vivo. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2015; 19 (4): 63–71.Popova IV, Stepanova AO, Sergeevichev DS, Akulov AE, Zakharova IS, Pokushalov AA et al. Comparative study of three vascular grafts produced by electrospinning in vitro and in vivo. Patologiya krovoobrashcheniya i kardiokhirurgiya. 2015; 19 (4): 63–71.Chen X, Yao Y, Liu S, Hu Q. An integrated strategy for designing and fabricating triple-layer vascular graft with oriented microgrooves to promote endothelialization. J Biomater Appl. 2021; 36: 297–310. doi: 10.1177/08853282211001006.Chen X, Yao Y, Liu S, Hu Q. An integrated strategy for designing and fabricating triple-layer vascular graft with oriented microgrooves to promote endothelialization. J Biomater Appl. 2021; 36: 297–310. doi: 10.1177/08853282211001006.Huang R, Gao X, Wang J, Chen H, Tong C, Tan Y, Tan Z. Triple-Layer Vascular Grafts Fabricated by Combined E-Jet 3D Printing and Electrospinning. Ann Biomed Eng. 2018; 46 (9): 1254–1266. doi: 10.1007/s10439-0182065-z.Huang R, Gao X, Wang J, Chen H, Tong C, Tan Y, Tan Z. Triple-Layer Vascular Grafts Fabricated by Combined E-Jet 3D Printing and Electrospinning. Ann Biomed Eng. 2018; 46 (9): 1254–1266. doi: 10.1007/s10439-0182065-z.Liu K, Wang N, Wang W, Shi L, Li H, Guo F et al. A bioinspired high strength three-layer nanofiber vascular graft with structure guided cell growth. J Mater Chem B. 2017; 5 (20): 3758–3764. doi: 10.1039/c7tb00465f.Liu K, Wang N, Wang W, Shi L, Li H, Guo F et al. A bioinspired high strength three-layer nanofiber vascular graft with structure guided cell growth. J Mater Chem B. 2017; 5 (20): 3758–3764. doi: 10.1039/c7tb00465f.Nemets EA, Surguchenko VA, Belov VYu, Xajrullina AI, Sevastyanov VI. Porous Tubular Scaffolds for Tissue Engineering Structures of Small Diameter Blood Vessels. Inorganic Materials: Applied Research. 2023; 14: 400– 407. doi: 10.1134/S2075113323020338.Nemets EA, Surguchenko VA, Belov VYu, Xajrullina AI, Sevastyanov VI. Porous Tubular Scaffolds for Tissue Engineering Structures of Small Diameter Blood Vessels. Inorganic Materials: Applied Research. 2023; 14: 400– 407. doi: 10.1134/S2075113323020338.Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro: ГОСТ ISO 109935-2023. М.: Российский институт стандартизации, 2023.Izdeliya meditsinskie. Otsenka biologicheskogo deystviya meditsinskikh izdeliy. Chast’ 5. Issledovanie na tsitotoksichnost’: metody in vitro: GOST ISO 109935-2023. M.: Rossiyskiy institut standartizatsii, 2023.Blache U, Guerrero J, Güven S, Klar AS, Scherberich A. Microvascular networks and models: in vitro formation. W. Holnthoner, A. Banfi, J. Kirkpatrick, H. Redleds. Vascularization for tissue engineering and regenerative medicine. Reference series in biomedical engineering. Springer, Cham. 2021: 345–383. doi: 10.1007/978-3319-54586-8.Blache U, Guerrero J, Güven S, Klar AS, Scherberich A. Microvascular networks and models: in vitro formation. W. Holnthoner, A. Banfi, J. Kirkpatrick, H. Redleds. Vascularization for tissue engineering and regenerative medicine. Reference series in biomedical engineering. Springer, Cham. 2021: 345–383. doi: 10.1007/978-3319-54586-8.Григорьев АМ, Басок ЮБ, Кириллова АД, Сургученко ВА, Шмерко НП, Кулакова ВК и др. Криогенноструктурированный гидрогель на основе желатина как резорбируемая макропористая матрица для биомедицинских технологий. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2022; 24 (2): 83–93. doi: 10.15825/1995-1191-2022-2-83-93.Grigoriev AM, Basok YuB, Kirillova AD, Surguchenko VA, Shmerko NP, Kulakova VK et al. Cryogenically structured gelatin-based hydrogel as a resorbable macroporous matrix for biomedical technologies. Russian Journal of Transplantology and Artificial Organs. 2022; 24 (2): 83–93. doi: 10.15825/1995-1191-2022-2-83-93.Rampersad SN. Multiple applications of alamar blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors. 2012; 12: 12347– 12360. doi: 10.3390/s120912347.Rampersad SN. Multiple applications of alamar blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors. 2012; 12: 12347– 12360. doi: 10.3390/s120912347.Wang Z, Liu S, Guidoin R, Kodama M. Polyurethane vascular grafts with thorough porosity: does an internal or an external membrane wrapping improve their in vivo blood compatibility and biofunctionality? Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2004; 32 (3): 463– 484. doi: 10.1081/bio-200027524.Wang Z, Liu S, Guidoin R, Kodama M. Polyurethane vascular grafts with thorough porosity: does an internal or an external membrane wrapping improve their in vivo blood compatibility and biofunctionality? Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2004; 32 (3): 463– 484. doi: 10.1081/bio-200027524.Tara S, Kurobe H, Rocco KA, Maxfield MW, Best CA, Yi T et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(Llactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 2014; 237 (2): 684–691. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.09.030.Tara S, Kurobe H, Rocco KA, Maxfield MW, Best CA, Yi T et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(Llactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 2014; 237 (2): 684–691. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.09.030.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.