Григорьев Алексей Михайлович
123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1
Тел. (499) 193-86-62
Alexei Grigoriev
1, Shchukinskaya str., Moscow, 123182
Phone: (499) 193-86-62
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Казань
Moscow
Kazan
Москва
Moscow
Цель работы: исследование биологических свойств макропористого криоструктурата из концентрированного коллагенсодержащего раствора в качестве перспективной матрицы для формирования клеточно- и тканеинженерных конструкций.
Материалы и методы. Макропористый губчатый носитель получали методом криоструктурирования коллагенсодержащего экстракта, приготовленного путем уксуснокислого гидролиза соединительной ткани цыплят (АО «БИОМИР сервис», РФ). Для придания водонерастворимости криоструктурату использовали N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимид (Sigma-Aldrich, США). Исследование микроморфологии поверхности губки проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии. Цитотоксичность носителя оценивали по реакции клеточной культуры фибробластов мыши NIH 3T3 с использованием автоматического микроскопа IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, США). Биосовместимость макропористого носителя изучали на культурах мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч), линейных клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 и линейных клетках эндотелия пупочной вены человека EA.hy926. Определяли метаболическую активность клеток с использованием реагентов PrestoBlue™ (Invitrogen™, США). Развитие клеточной популяции при долговременном культивировании клеточно-инженерной конструкции (КИК) оценивали с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии по всей поверхности образца с использованием инвертированного микроскопа Leica Dmi8 с програмным обеспечением Leica Thunder (Leica Microsystems, ФРГ).
Результаты. Оптическая микроскопия и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) показали наличие в полученном биополимерном материале пор разного размера: крупных, диаметром 237 ± 32 мкм, средних – 169 ± 23 мкм и малых – 70 ± 20 мкм; преимущественно наблюдали поры крупных и средних размеров. Исследуемые носители не проявляли цитотоксичности. Наблюдали адгезию и пролиферацию клеток на поверхности материала и их проникновение в подлежащие слои при долговременном культивировании. Наибольшая метаболическая активность клеток наблюдалась для МСК ЖТч на 14-е сутки, что соответствует нормальной динамике развития популяции клеток данного типа. В модели КИК печени была показана функциональная активность клеток HepG2 – продуцирование альбумина и мочевины.
Заключение. Хорошая адгезия и активная пролиферация, показанная для трех типов клеток, свидетельствует о биосовместимости полученного биополимерного носителя, а распространение клеток во внутренний объем губки и ее активное заселение при долговременном культивировании указывает на целесообразность использования данного материала для создания клеточно- и тканеинженерных конструкций.
Objective: to study the biological properties of macroporous cryostructurate from multicomponent concentrated collagen-containing solution (MCCS) as a promising matrix for the formation of cell- and tissue-engineered constructs.
Materials and methods. A macroporous spongy carrier was obtained by cryostructuring of collagencontaining extract, prepared by acetic acid hydrolysis of chicken connective tissue (BIOMIR Service, Russian Federation). N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide (Sigma-Aldrich, USA) was used to make the cryostructurate water insoluble. The micromorphology of the sponge surface was studied using scanning electron microscopy. The cytotoxicity of the carrier was evaluated by reaction of the mouse NIH 3T3 fibroblast cell culture using automated microscope IncuCyte ZOOM (EssenBioscience, USA). Biocompatibility of the macroporous carrier was studied on cultures of human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells (AD-MSC), human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and human umbilical vein endothelial cell line EA.hy926. The metabolic activity of cells was determined using PrestoBlue™ reagents (Invitrogen™, USA). Cell population development during long-term cultivation of the cell-engineered construct (CEC) was assessed by fluorescencelifetime imaging microscopy over the entire surface of the sample using a Leica Dmi8 inverted microscope with Leica Thunder software (Leica Microsystems, Germany).
Results. Optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM) showed the presence of pores of different sizes in the resulting biopolymer material: large pores with 237 ± 32 μm diameter, medium-sized pores with 169 ± 23 μm diameter, and small-sized pores with 70 ± 20 μm diameter; large and medium-sized pores were predominant. The studied media did not exhibit cytotoxicity. Cell adhesion and proliferation on the surface of the material and their penetration into the underlying layers during long-term cultivation were observed. The highest metabolic activity of the cells was observed for human AD-MSC on day 14, which corresponds to the normal dynamics of development of a population of cells of this type. The functional activity of HepG2 cells – albumin and urea production – was shown in the liver CEC model.
Conclusion. The good adhesion and active proliferation that were shown for the three cell types indicate that the resulting biopolymer carrier is biocompatible, and that the spread of the cells into the inner volume of the sponge and active population of the sponge under prolonged culturing indicates that this material can be used to create cell- and tissue-engineered constructs.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.