Нефедова Ольга Николаевна.
127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59а
Тел. (915) 489-59-15
Olga Nefedova
59a, Beskudnikovskiy Bul’var, Moscow, 127486
Phone: (915) 489-59-15
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Цель: в эксперименте in vitro изучить выживаемость и сохранность пролиферативной активности лимбальных стволовых клеток (ЛСК) в фрагментах ткани лимба, выкроенных фемтосекундным лазером (ФСЛ).
Материалы и методы. Из донорских кадаверных глаз (n = 8) в верхней и нижней частях лимба, содержащих наибольшее количество лимбальных стволовых клеток, фемтосекундным лазером модели Z8 (Ziemer, Швейцария) формировали лимбальные фрагменты, которые фрагментировали на 4 мини-трансплантата с применением разных уровней энергии (100, 110, 120%). Контролем служили мини-трансплантаты из симметричных участков кадаверных глаз, которые выделяли мануально при помощи микрохирургического лезвия. Культивирование мини-трансплантатов проводили на протяжении двух недель в культуральных средах, предназначенных для лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК) (Epilife (0,06 мМ Ca++) и для мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) (DMEM/F12) с добавлением специфических факторов роста с целью избирательного стимулирования ЛЭСК или ММСК соответственно. Фенотип полученных культивированных клеток в группах «лазер» и «нож» определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора маркеров к мембранным белкам ЛЭСК и ММСК: CD166, CD105, CD90, CD29, CD34. Способность культивированных клеток к адгезии и пролиферации в группах «лазер» и «нож» определяли путем посева третьего пассажа полученных культур на Боуменову мембрану бесклеточных роговиц.
Результаты. Первичную культуру клеток получили из мини-трансплантатов всех доноров в обеих группах. Морфология клеток соответствовала фенотипу эпителиальных клеток роговицы (паттерн по типу «булыжной мостовой»). При культивировании в среде EpiLife (0,06 мМ Ca++) определили наличие пролиферации ЛСК из 38,6% мини-трансплантатов, в среде DMEM/F12 (1 : 1) – из 31,8%. Через две недели выход клеток из мини-трансплантатов в группах «лазер» и «нож» составил 77,2 и 63,6% соответственно. Рост клеток к концу второй недели культивирования мини-трансплантатов, полученных ФСЛ на энергиях 120, 110 и 100%, составил соответственно 87,5; 71,4 и 71,4%. Было установлено, что полученные культуры клеток в группах «лазер» и «нож» и подгруппах «120%», «110%» и «100%» фенотипически не отличались. Анализ методом цитофлуориметрии показал, что культуры клеток в группах имели смешанный паттерн экспрессии маркеров как ЛЭСК (CD29+), так и ММСК (CD90+, CD105+). Посев третьего пассажа культуры клеток в исследуемых группах во всех случаях продемонстрировал адгезию и формирование на Боуменовой мембране модельных роговиц монослоя клеток.
Заключение. Применение ФСЛ для выкраивания лимбальных трансплантатов представляется нам эффективным и безопасным по сравнению с традиционной механической (ножевой) методикой. Культуры клеток, полученные из мини-трансплантатов, выкроенных ФСЛ, были способны к росту и миграции на протяжении как минимум 21 суток.
Objective: to study in vitro survival and preservation of the proliferative activity of limbal stem cells (LSCs) in femtosecond laser-cut limbal tissue fragments.
Materials and methods. Limbal fragments were formed from donor cadaver eyes (n = 8) in the upper and lower limbus containing the highest number of limbal stem cells, using a Z8 femtosecond laser (FSL) (Ziemer, Switzerland). The limbal fragments were fragmented into 4 mini-grafts using different energy levels (100, 110, 120%). Mini-grafts from symmetrical sections of the cadaver eyes, which were manually isolated using a microsurgical blade, served as controls. The mini-grafts were cultured for two weeks in culture media intended for limbal epithelial stem cells (LESCs) (Epilife (0.06 mM Ca++) and for multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) (DMEM/F12), with the addition of specific growth factors to selectively stimulate LESCs or MMSCs, respectively. The phenotype of the obtained cultured cells in the «laser» and «knife» groups was determined by flow cytometry using a set of markers (CD166, CD105, CD90, CD29, CD34) for the membrane proteins of LESCs and MMSCs. The ability of cultured cells to adhesion and proliferation in the «laser» and «knife» groups was determined by seeding the third passage of the resulting cultures on Bowman’s membrane of acellular corneas.
Results. Primary cell culture was obtained from mini-grafts of all donors in both groups. Cell morphology was consistent with the phenotype of corneal epithelial cells (cobblestone pattern). When cultured in the EpiLife medium (0.06 mM Ca++), we determined the presence of LSCs proliferation from 38.6% of minigrafts; in the DMEM/F12 medium (1 : 1) the presence was determined from 31.8%. Two weeks later, cell yield from mini-grafts in the «laser» and «knife» groups was 77.2% and 63.6%, respectively. Cell growth by the end of week 2 of culturing of mini-grafts obtained by FSL at 120, 110 and 100% energies was 87.5, 71.4 and 71.4%, respectively. It was found that the resulting cell cultures in the «laser» and «knife» groups and in the «120%», «110%» and «100%» subgroups were not different phenotypically. Cytofluorimetric analysis showed that cell cultures in the groups had a mixed pattern of marker expression of both LESCs (CD29+) and MMSCs (CD90+, CD105+). Seeding of the third passage of cell culture in the test groups in all cases demonstrated adhesion and formation of a cell monolayer on the Bowman’s membrane of model corneas.
Conclusion. The use of FSL for cutting out limbal grafts seems to be effective and safe in comparison with the traditional mechanical (knife) technique. Cell cultures obtained from FSL-cut mini-grafts were able to grow and migrate for at least 21 days.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.