Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Ли Валерий Герасимович
127486, Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59а
Valeriy Li
59a, Beskudnikovsky Boulevard, Moscow, 127486
Москва
Moscow
Москва
Moscow
Введение. Актуальной проблемой офтальмологии является дефицит донорских роговиц. Данный факт обусловливает поиск новых альтернативных путей для лечения патологий роговицы. Технологии децеллюляризации позволяют создавать роговичные тканеинженерные конструкции, которые могут решить проблему нехватки донорских роговиц.
Цель. Провести сравнительный анализ эффективных методов обработки роговичной лентикулы и создать оптимизированный и стандартизированный протокол децеллюляризации.
Материалы и методы. Для исследования были выбраны стромальные роговичные лентикулы, полученные после операции ReLEx SMILE. Параметры лентикул: толщина 77–120 мкм, диаметр 6,5 мм. Для обработки лентикулы использовали 3 протокола: 1) обработка 1,5 М хлоридом натрия с нуклеазами (NaCl); 2) 0,1% SDS (SDS); 3) обработка раствором Трипсин-ЭДТА с последующем двойным отмыванием в гипотоническом трис-буферном растворе с нуклеазами (Трипсин-ЭДТА). Оптические свойства лентикул определяли спектрофотометрически, где в качестве контроля служили образцы до децеллюляризации. Определение структуры стромы роговичной лентикулы после децеллюляризации происходило с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и альциановым синим. Также в качестве дополнительного метода оценки состояния внеклеточного матрикса, а именно коллагена I, III, V и VI типов, проводили иммуногистохимический анализ криосрезов нативных обработанных лентикул. Флуоресцентная визуализация ядерного материла в исходных криосрезах производилась с помощью красителя Hoechst. Состояние ультраструктуры коллагеновых волокон оценивалось с помощью сканирующего электронного микроскопирования. Производили анализ количественного содержания ДНК в свежих лентикулах и в лентикулах после обработки.
Результаты. Все три протокола децеллюляризации эффективно удаляют ядерный и клеточный материал, остаточное содержание ДНК было < 50 нг/мг. Однако протокол с Трипсин-ЭДТА приводит к значительному повреждению структуры внеклеточного матрикса, что отрицательно сказывается на прозрачности роговичных тканеинженерных конструкций. Прозрачность образцов для протокола NaCl была приближена к нативным лентикулам.
Заключение. Для создания роговичной тканеинженерной конструкции протокол децеллюляризации NaCl представляется оптимизированным и может применяться для лечения различных патологий роговицы.
Shortage of donor corneas is a burning issue in ophthalmology. That is why there is a search for new alternative ways for treating corneal diseases. Decellularization technologies make it possible to create corneal tissue-engineered constructs that can adrress the issue of donor corneal shortage. Objective: to conduct a comparative analysis of effective methods for treating the corneal lenticula and to create an optimized and standardized decellularization protocol. Materials and methods. Corneal stromal lenticules obtained after ReLEx SMILE surgery were chosen for the study. Lenticule parameters: thickness 77–120 microns, diameter 6.5 mm. We used 3 protocols for the treatment of lenticules: 1) treatment with 1.5 M sodium chloride with nucleases (NaCl); 2) 0.1% SDS (SDS); 3) treatment with Trypsin-EDTA solution, followed by double washing in a hypotonic Tris buffer solution with nucleases (Trypsin-EDTA). Optical properties of lenticles were determined spectrophotometrically, where the samples before decellularization served as a control. Fluorescence imaging of nuclear material in the original cryosections was performed using Hoechst dye. The state of collagen fiber ultrastructure was assessed by scanning electron microscopy. The quantitative DNA content in fresh lenticules and in lenticules after treatment was analyzed. Results. All three decellularization protocols effectively removed nuclear and cellular material; the residual DNA content was < 50 ng/mg. However, the Trypsin-EDTA protocol led to significant damage to the extracellular matrix structure, which negatively affected the transparency of corneal tissue-engineered constructs. Transparency of samples for the NaCl protocol was close to native lenticules. Conclusion. To create a corneal tissue-engineered construct, NaCl decellularization protocols appear to be optimized and can be used to treat various corneal diseases.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.