vtioВестник трансплантологии и искусственных органовRussian Journal of Transplantology and Artificial Organs1995-1191Academician V.I.Shumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs", Ministry of Health of the Russian Federation10.15825/1995-1191-2020-3-123-133vtio-1235Research ArticleРегенеративная медицина и клеточные технологииRegenerative Medicine and Cell TechnologiesЭкспериментальные подходы к созданию тканеспецифического матрикса для биоискусственной печениExperimental approaches to creating a tissue-specific matrix for a bioartificial liverГригорьевА. М.GrigorievA. M.

Григорьев Алексей Михайлович.

Адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1. 

Тел. (499) 193-86-62. 

Alexey Grigoriev.

Address: 1, Shchukinskaya str., Moscow, 123182, Russian Federation. 

Phone: (499) 193-86-62.

Bear-38@yandex.ruБасокЮ. Б.BasokYu. B.

Москва

Moscow

КирилловаА. Д.KirillovaA. D.

Москва

Moscow

КирсановаЛ. А.KirsanovaL. A.

Москва

Moscow

ШмеркоН. П.ShmerkoN. P.

Москва

Moscow

СубботА. М.SubbotA. M.

Москва

Moscow

НемецЕ. А.NemetsE. A.

Москва

Moscow

МилосердовИ. А.MiloserdovI. A.

Москва

Moscow

ШагидулинМ. Ю.ShagidulinM. Yu.

Москва

Moscow

СевастьяновВ. И.SevastyanovV. I.

Москва

Moscow

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава РоссииРоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial OrgansRussian FederationФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»РоссияResearch Institute of Eye DiseasesRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)РоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs; Sechenov UniversityRussian Federation202006102020223123133Copyright © Григорьев А.М., Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Кирсанова Л.А., Шмерко Н.П., Суббот А.М., Немец Е.А., Милосердов И.А., Шагидулин М.Ю., Севастьянов В.И., 20202020Григорьев А.М., Басок Ю.Б., Кириллова А.Д., Кирсанова Л.А., Шмерко Н.П., Суббот А.М., Немец Е.А., Милосердов И.А., Шагидулин М.Ю., Севастьянов В.И.Grigoriev A.M., Basok Y.B., Kirillova A.D., Kirsanova L.A., Shmerko N.P., Subbot A.M., Nemets E.A., Miloserdov I.A., Shagidulin M.Y., Sevastyanov V.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.transpl.ru/vtio/article/view/1235

Дефицит донорских органов для трансплантации печени при лечении терминальных стадий печеночной недостаточности диктует необходимость разработки альтернативных методов, к которым относятся технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины. Целью работы было исследование способности тканеспецифического матрикса из децеллюляризованных фрагментов печени человека (ДФПч) поддерживать адгезию и пролиферацию мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) и HepG2 в статических условиях и в проточном биореакторе. Материалы и методы. Для децеллюляризации фрагментов (не более 8 мм3) печени человека использовали обработку поверхностноактивными веществами (ПАВ) – додецилсульфатом натрия, Тритоном Х-100 с последующей экспозицией в ДНКазе. Биохимические исследования включали определение количества ДНК в исследуемых образцах. Эффективность отмывки от ПАВ оценивали по цитотоксичности матрикса на культуре фибробластов NIH 3T3. Оценку жизнеспособности и метаболической активности клеток проводили методом прижизненного окрашивания комплексом флюоресцентных красителей LIVE/DEAD ® и PrestoBlue™ (Invitrogen, США). Морфологическое исследование клеточно-инженерных конструкций печени проводили с использованием методов гистологического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием. Результаты. Показано, что использованная методика децеллюляризации печени позволяет получать биосовместимый матрикс с остаточным количеством ДНК менее 1%, способный поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2. В биореакторе на 7-е сутки культивирования наблюдали образование единого конгломерата матрикса ДФПч с многочисленными группами жизнеспособных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Содержание мочевины в культуральной среде превышает значение для образцов, полученных в статических условиях, и составляет 1,5 ± 0,1 ммоль/л, что свидетельствует о метаболической активности HepG2 в составе полученных культуральных систем. Показано, что постоянный поток культуральной среды перфузионного биореактора способствовал росту пролиферативой активности HepG2 и позволил обеспечить более равномерную колонизацию клетками матрикса по сравнению со статическими условиями культивирования. Заключение. Найдены условия равномерного заселения ДФПч в проточном биореакторе клеточными культурами. Способность матрикса поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч и HepG2 в течение 11 суток свидетельствует о возможности его использования в тканевой инженерии печени.

Shortage of donor organs for liver transplantation in the treatment of end-stage liver disease dictates the need to develop alternative methods that include technologies on tissue engineering and regenerative medicine. Objective: to study the ability of a tissue-specific matrix from decellularized human liver fragments (DHLF) to maintain adhesion and proliferation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAT-MSCs) and HepG2 under static conditions and in a flow-through bioreactor. Materials and methods. Treatment with surfactants (SAS) – sodium dodecyl sulfate, Triton X-100 – followed by exposure to DNase was used for decellularization of human liver fragments (no more than 8 mm3). Biochemical screening included the determination of DNA quantity in the test samples. Efficiency of surfactant washing was assessed by the cytotoxicity of the matrix in the NIH 3T3 fibroblast culture. Viability and metabolic activity of cells were assessed via vital staining with a complex of fluorescent dyes LIVE/DEAD ® and PrestoBlue™ (Invitrogen, USA). Morphological examination of the liver cell-engineered constructs was carried out through histological staining and scanning electron microscopy with lanthanide contrast. Results. It was shown that the liver decellularization method used allows to obtain a biocompatible matrix with a residual DNA quantity <1%, which is capable of maintaining adhesion and proliferation of hAT-MSCs and HepG2. On day 7 of cultivation in the bioreactor, there was formation of a single conglomerate of the DHLF matrix with numerous groups of viable cells with a high nuclear-cytoplasmic ratio. The urea content in the culture medium is 1.5 ± 0.1 mmol/L, exceeding that of samples obtained under static conditions. This indicates the metabolic activity of HepG2 in the composition of the obtained culture systems. It was shown that constant flow of the culture medium in the perfusion bioreactor increased the proliferative activity of HepG2 and allowed to provide a more uniform colonization by matrix cells in comparison with static cultivation conditions. Conclusion. The conditions for uniform colonization of DHLFs in a flow-through bioreactor with cell cultures were established. The ability of the matrix to maintain adhesion and proliferation of hADSCs and HepG2 for 11 days indicates that it could be used in liver tissue engineering.

печеньдецеллюляризациямезенхимальные стромальные клеткиHepG2клеточно-инженерная конструкциятканевая инженериябиореакторliverdecellularizationmesenchymal stem cellsHepG2cell-engineered constructtissue engineeringbioreactorРабота выполнена частично при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-29-06012).ReferencesCroce S, Peloso A, Zoro T, Avanzini MA, Cobianchi L. A hepatic scaffold from decellularized liver tissue: food for thought. Biomolecules. 2019; 9 (12): 813. doi: 10.3390/biom9120813. PMID: 31810291.Croce S, Peloso A, Zoro T, Avanzini MA, Cobianchi L. A hepatic scaffold from decellularized liver tissue: food for thought. Biomolecules. 2019; 9 (12): 813. doi: 10.3390/biom9120813. PMID: 31810291.Yang W, Xia R, Zhang Y, Zhang H, Bai L. Decellularized liver scaffold for liver regeneration. Methods Mol Biol. 2018; 1577: 11–23. doi: 10.1007/7651_2017_53. PMID: 28856614.Yang W, Xia R, Zhang Y, Zhang H, Bai L. Decellularized liver scaffold for liver regeneration. Methods Mol Biol. 2018; 1577: 11–23. doi: 10.1007/7651_2017_53. PMID: 28856614.Bilodeau C, Goltsis O, Rogers IM, Post M. Limitations of recellularized biological scaffolds for human transplantation. J Tissue Eng Regen Med. 2020; 14 (3): 521–538. doi: 10.1002/term.3004. PMID: 31826325.Bilodeau C, Goltsis O, Rogers IM, Post M. Limitations of recellularized biological scaffolds for human transplantation. J Tissue Eng Regen Med. 2020; 14 (3): 521–538. doi: 10.1002/term.3004. PMID: 31826325.Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: a systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 2018; 19 (12): 4117. doi: 10.3390/ijms19124117. PMID: 30567407.Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: a systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 2018; 19 (12): 4117. doi: 10.3390/ijms19124117. PMID: 30567407.Ahmed E, Saleh T, Yu L, Kwak HH, Kim BM, Park KM et al. Micro and ultrastructural changes monitoring during decellularization for the generation of a biocompatible liver. J Biosci Bioeng. 2019; 128 (2): 218–225. doi: 10.1016/j.jbiosc.2019.02.007. PMID: 3090445.Ahmed E, Saleh T, Yu L, Kwak HH, Kim BM, Park KM et al. Micro and ultrastructural changes monitoring during decellularization for the generation of a biocompatible liver. J Biosci Bioeng. 2019; 128 (2): 218–225. doi: 10.1016/j.jbiosc.2019.02.007. PMID: 3090445.Willemse J, Verstegen MMA, Vermeulen A, Schurink IJ, Roest HP, van der Laan LJW et al. Fast, robust and effective decellularization of whole human livers using mild detergents and pressure controlled perfusion. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020; 108: 110200. doi: 10.1016/j.msec.2019.110200. PMID: 31923991.Willemse J, Verstegen MMA, Vermeulen A, Schurink IJ, Roest HP, van der Laan LJW et al. Fast, robust and effective decellularization of whole human livers using mild detergents and pressure controlled perfusion. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020; 108: 110200. doi: 10.1016/j.msec.2019.110200. PMID: 31923991.Butter A, Aliyev K, Hillebrandt KH, Raschzok N, Kluge M, Seiffert N et al. Evolution of graft morphology and function after recellularization of decellularized rat livers. J Tissue Eng Regen Med. 2018; 12 (2): e807–e816. doi: 10.1002/term.2383. PMID: 27957815.Butter A, Aliyev K, Hillebrandt KH, Raschzok N, Kluge M, Seiffert N et al. Evolution of graft morphology and function after recellularization of decellularized rat livers. J Tissue Eng Regen Med. 2018; 12 (2): e807–e816. doi: 10.1002/term.2383. PMID: 27957815.Naeem EM, Sajad D, Talaei-Khozani T, Khajeh S, Azarpira N, Alaei S et al. Decellularized liver transplant could be recellularized in rat partial hepatectomy model. J Biomed Mater Res A. 2019; 107 (11): 2576–2588. doi: 10.1002/jbm.a.36763. PMID: 31361939.Naeem EM, Sajad D, Talaei-Khozani T, Khajeh S, Azarpira N, Alaei S et al. Decellularized liver transplant could be recellularized in rat partial hepatectomy model. J Biomed Mater Res A. 2019; 107 (11): 2576–2588. doi: 10.1002/jbm.a.36763. PMID: 31361939.Готье СВ, Севастьянов ВИ, Шагидулин МЮ, Немец ЕА, Басок ЮБ. Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения. Патент на изобретение RU 2693432 C2, 02.07.2019.Gautier SV, Sevastyanov VI, Shagidulin MYu, Nemets EA, Basok YuB. Tkanespetsificheskiy matriks dlya tkanevoy inzhenerii parenkhimatoznogo organa i sposob ego polucheniya. Patent na izobretenie RU 2693432 C2, 02.07.2019.Elchaninov A, Fatkhudinov T, Usman N, Arutyunyan I, Makarov A, Lokhonina A et al. Multipotent stromal cells stimulate liver regeneration by influencing the macrophage polarization in rat. World J Hepatol. 2018 Feb 27; 10 (2): 287–296.; Zhou Q, Li L, Li J. Stem cells with decellularized liver scaffolds in liver regeneration and their potential clinical applications. Liver Int. 2015 Mar; 35 (3): 687–694. doi: 10.1111/liv.12581.Elchaninov A, Fatkhudinov T, Usman N, Arutyunyan I, Makarov A, Lokhonina A et al. Multipotent stromal cells stimulate liver regeneration by influencing the macrophage polarization in rat. World J Hepatol. 2018 Feb 27; 10 (2): 287–296.; Zhou Q, Li L, Li J. Stem cells with decellularized liver scaffolds in liver regeneration and their potential clinical applications. Liver Int. 2015 Mar; 35 (3): 687–694. doi: 10.1111/liv.12581.Shimoda H, Yagi H, Higashi H, Tajima K, Kuroda K, Abe Y et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Sci Rep. 2019; 9 (1): 12543. doi: 10.1038/s41598-019-48948-x. PMID: 31467359.Shimoda H, Yagi H, Higashi H, Tajima K, Kuroda K, Abe Y et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Sci Rep. 2019; 9 (1): 12543. doi: 10.1038/s41598-019-48948-x. PMID: 31467359.Donato MT, Tolosa L, Gómez-Lechón MJ. Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells. Methods Mol Biol. 2015; 1250: 77–93. doi: 10.1007/978-1-4939-2074-7_5.Donato MT, Tolosa L, Gómez-Lechón MJ. Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells. Methods Mol Biol. 2015; 1250: 77–93. doi: 10.1007/978-1-4939-2074-7_5.Sevastyanov VI, Basok YB, Grigoryev AM, Kirsanova LA, Vasilets VN. A perfusion bioreactor for making tissue-engineered constructs. Biomedical Engineering. 2017; 51 (3): 162–165.Sevastyanov VI, Basok YB, Grigoryev AM, Kirsanova LA, Vasilets VN. A perfusion bioreactor for making tissue-engineered constructs. Biomedical Engineering. 2017; 51 (3): 162–165.ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». М.: Стандартинформ, 2014.GOST ISO 10993-1-2011 «Izdeliya meditsinskie. Otsenka biologicheskogo deystviya meditsinskikh izdeliy. Chast’ 5. Issledovanie na tsitotoksichnost’: metody in vitro». M.: Standartinform, 2014.Novikov I, Subbot A, Turenok A, Mayanskiy N, Chebotar I. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride. Micron. 2019; 124: 102687. doi: 10.1016/j.micron.2019.102687. PMID: 31302532.Novikov I, Subbot A, Turenok A, Mayanskiy N, Chebotar I. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride. Micron. 2019; 124: 102687. doi: 10.1016/j.micron.2019.102687. PMID: 31302532.Zhang L, Guan Z, Ye J-S, Yin Y-F, Stoltz J-F, de Isla N. Research progress in liver tissue engineering. Biomed Mater Eng. 2017; 29 (s1): S113–S119.Zhang L, Guan Z, Ye J-S, Yin Y-F, Stoltz J-F, de Isla N. Research progress in liver tissue engineering. Biomed Mater Eng. 2017; 29 (s1): S113–S119.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Nibourg GA, Hoekstra R, van der Hoeven TV, Ackermans MT, Hakvoort TB, van Gulik TM, Chamuleau RA. Increased hepatic functionality of the human hepatoma cell line HepaRG cultured in the AMC bioreactor. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Aug; 45 (8): 1860–1868.Nibourg GA, Hoekstra R, van der Hoeven TV, Ackermans MT, Hakvoort TB, van Gulik TM, Chamuleau RA. Increased hepatic functionality of the human hepatoma cell line HepaRG cultured in the AMC bioreactor. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Aug; 45 (8): 1860–1868.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.