vtioВестник трансплантологии и искусственных органовRussian Journal of Transplantology and Artificial Organs1995-1191Academician V.I.Shumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs", Ministry of Health of the Russian Federation10.15825/1995-1191-2020-1-123-133vtio-1153Research ArticleРЕГЕНЕРАТИВНАЯ МЕДИЦИНА И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИREGENERATIVE MEDICINE AND CELL TECHNOLOGIESДецеллюляризация фрагмента донорской поджелудочной железы для получения тканеспецифического матриксаDecellularization of donor pancreatic fragment to obtain a tissue-specific matrix scaffoldПономареваА. С.PonomarevaA. S.

Пономарева Анна Сергеевна. 

123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

Ponomareva Anna Sergeevna. 

1, Shchukinskaya str., Moscow, 123182

a.s.ponomareva@gmail.comКирсановаЛ. А.KirsanovaL. A.

Москва

Moscow

БарановаН. В.BaranovaN. V.

Москва

Moscow

СургученкоВ. А.SurguchenkoV. A.

Москва

Moscow

БубенцоваГ. Н.BubentsovaG. N.

Москва

Moscow

БасокЮ. Б.BasokYu. B.

Москва

Moscow

МилосердовИ. А.MiloserdovI. A.

Москва

Moscow

СевастьяновВ. И.SevastianovV. I.

Москва

Moscow

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава РоссииРоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial OrgansRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)РоссияShumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs; Sechenov UniversityRussian Federation202022042020221123133Copyright © Пономарева А.С., Кирсанова Л.А., Баранова Н.В., Сургученко В.А., Бубенцова Г.Н., Басок Ю.Б., Милосердов И.А., Севастьянов В.И., 20202020Пономарева А.С., Кирсанова Л.А., Баранова Н.В., Сургученко В.А., Бубенцова Г.Н., Басок Ю.Б., Милосердов И.А., Севастьянов В.И.Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Baranova N.V., Surguchenko V.A., Bubentsova G.N., Basok Y.B., Miloserdov I.A., Sevastianov V.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.transpl.ru/vtio/article/view/1153

Одной из актуальных задач тканевой инженерии является получение искусственного матрикса, способного имитировать для клеток микроокружение биологической среды. Таким матриксом при создании биоинженерной конструкции поджелудочной железы (ПЖ) может быть тканеспецифический каркас, полученный из децеллюляризованной ткани ПЖ. Цель: получение и исследование характеристических свойств тканеспецифического каркаса поджелудочной железы из децеллюляризованных фрагментов панкреатической ткани человека. Материалы и методы. Протокол децеллюляризации включал в себя 3 цикла замораживания и оттаивания фрагментов ПЖ с последующей обработкой поверхностно-активными веществами – додецилсульфатом натрия и Тритоном Х100. На каждом этапе децеллюляризации проводили рутинное окрашивание образцов гематоксилином и эозином и на общий коллаген. Дополнительно проводили иммуногистохимический анализ срезов децеллюляризованной ПЖ человека (ДПЖч) на коллаген I типа и эластические волокна. Ядра клеток в исходных образцах и полученном матриксе визуализировали, используя флуоресцентное окрашивание DAPI. Определяли количество ДНК в нативной и децеллюляризованной ткани ПЖ. Цитотоксичность тканеспецифического матрикса оценивали in vitro методом прямого контакта. Матриксные свойства образцов ДПЖч определяли с использованием МСК жировой ткани человека. Результаты. Предложен способ децеллюляризации ПЖ, позволяющий получение тканеспецифического матрикса в виде соединительно-тканного каркаса, полностью свободного от детрита с сохранной тонковолокнистой сетевидной структурой, в которой выявлены эластические и коллагеновые волокна, в том числе коллагена I типа. Окрашивание DAPI подтверждало отсутствие ядерного материала в децеллюляризованном матриксе, а остаточное количество ДНК не превышало 0,1%. Доказано отсутствие цитотоксичности матрикса и его способность поддерживать адгезию и пролиферацию МСК ЖТч. Заключение. Как один из этапов создания биоинженерной конструкции ПЖ, разработан способ получения биосовместимого (отсутствие цитотоксичности и иммуногенности) тканеспецифического каркаса из децеллюляризованной панкреатической ткани человека с сохранением морфофункциональных свойств нативного внеклеточного матрикса ПЖ и обеспечивающего адгезию и пролиферацию клеточных культур.

One of the pressing issues in tissue engineering is on how to obtain an artificial matrix that can simulate a biological microenvironment for cells. When creating a bioengineered pancreatic construct, a tissue-specific scaffold obtained from decellularized pancreatic tissue can serve as such matrix. Objective: to obtain and study the characteristic properties of a tissue-specific pancreas scaffold from decellularized human pancreatic fragments. Materials and methods. The decellularization protocol included 3 freeze/thaw cycles, followed by treatment with surfactants (sodium dodecyl sulfate and Triton X100). At each decellularization stage, samples were routinely stained with hematoxylin and eosin and for total collagen. In addition, immunohistochemical staining of decellularized human pancreas (DHP) for type I collagen and elastic fibers was performed. Cell nuclei in the original samples and the resulting matrix were visualized using DAPI fluorescent staining. DNA quantity in the native and decellularized pancreatic tissue was determined. The cytotoxicity of the tissue-specific matrix was evaluated in vitro by direct contact. The matrix properties of DHP samples were determined using mesenchymal stem cells (MSCs) of human adipose tissue. Results. A pancreatic decellularization method is proposed. This method allows to obtain a tissue-specific matrix in the form of a connective tissue scaffold completely free of detritus with preserved thin-fiber mesh-like structure, in which elastic and collagen fibers, including type I collagen, are identified. DAPI staining confirmed the absence of nuclear material in the decellularized matrix, while residual amount of DNA did not exceed 0.1%. Absence of matrix cytotoxicity and its ability to maintain adhesion and proliferation of human adipose tissue-derived MSCs was proved. Conclusion. As one of the stages in creating a bioengineered pancreatic construct, a method has been developed for producing a biocompatible (lack of cytotoxicity and immunogenicity) tissue-specific scaffold from decellularized human pancreatic tissue. In the scaffold, the morphofunctional properties of the native extracellular matrix-based scaffolds of the pancreas are preserved. Adhesion and proliferation of cell cultures are ensured.

поджелудочная железадецеллюляризациятканеспецифический каркастканевая инженерияpancreasdecellularizationtissue-specific scaffoldtissue engineeringReferencesСургученко ВА. Матриксы для тканевой инженерии и гибридных органов. Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. М.: МИА, 2011. Часть II, глава 1: 199–226.Surguchenko VA. Matriksy dlya tkanevoj inzhenerii i gibridnyh organov. Biosovmestimye materialy (uchebnoe posobie). Pod red. V.I. Sevast’yanova i M.P. Kirpichnikova. M.: MIA, 2011. Chast’ II, glava 1: 199–226.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011 April; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011 April; 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Sackett SD, Tremmel DM, Ma F, Feeney AK, Maguire RM, Brown ME et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 2018; 8: 10452. doi: 10.1038/s41598-018-28857-1.Sackett SD, Tremmel DM, Ma F, Feeney AK, Maguire RM, Brown ME et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 2018; 8: 10452. doi: 10.1038/s41598-018-28857-1.Stendahl JC, Kaufman DB, Stupp SI. Extracellular Matrix in Pancreatic Islets: Relevance to Scaffold Design and Transplantation. Cell Transplant. 2009; 18 (1): 1–12. doi: 10.3727/096368909788237195.Stendahl JC, Kaufman DB, Stupp SI. Extracellular Matrix in Pancreatic Islets: Relevance to Scaffold Design and Transplantation. Cell Transplant. 2009; 18 (1): 1–12. doi: 10.3727/096368909788237195.Riopel M, Wang К. Collagen matrix support of pancreatic islet survival and function. Frontiers in Bioscience. 2014 Jan; 19: 77–90. doi: 10.2741/4196.Riopel M, Wang К. Collagen matrix support of pancreatic islet survival and function. Frontiers in Bioscience. 2014 Jan; 19: 77–90. doi: 10.2741/4196.Salvatori M, Katari R, Patel T, Peloso A, Mugweru J, Owusu K, Orlando G. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 2014; 8 (1): 159–169. doi: 10.1177/1932296813519558.Salvatori M, Katari R, Patel T, Peloso A, Mugweru J, Owusu K, Orlando G. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 2014; 8 (1): 159–169. doi: 10.1177/1932296813519558.Wu D, Wan J, Huang Y, Guo Y, Xu T, Zhu M et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold: in vitro and in vivo Study. BioMed Research International. 2015 Nov: 1–8. http://dx.doi.org/10.1155/2015/432645.Wu D, Wan J, Huang Y, Guo Y, Xu T, Zhu M et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold: in vitro and in vivo Study. BioMed Research International. 2015 Nov: 1–8. http://dx.doi.org/10.1155/2015/432645.Goh SK, Bertera S, Olsen P, Candiello J, Halfter W, Uechi G et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 2013; 34 (28): 6760–6772. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.05.066.Goh SK, Bertera S, Olsen P, Candiello J, Halfter W, Uechi G et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 2013; 34 (28): 6760–6772. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.05.066.Napierala H, Hillebrandt K-H, Haep N, Tang P, Tintemann M, Gassner J et al. Engineering an endocrine Neo-Pancreas by repopulation of a decellularized rat pancreas with islets of Langerhans. Scientific Reports. 2017; 7: 41777. doi: 10.1038/srep41777.Napierala H, Hillebrandt K-H, Haep N, Tang P, Tintemann M, Gassner J et al. Engineering an endocrine Neo-Pancreas by repopulation of a decellularized rat pancreas with islets of Langerhans. Scientific Reports. 2017; 7: 41777. doi: 10.1038/srep41777.Mirmalek-Sani S-H, Orlando G, McQuilling J, Pareta R, Mack D, Salvatori M et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 2013; 34 (22): 5488–5495. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.03.054.Mirmalek-Sani S-H, Orlando G, McQuilling J, Pareta R, Mack D, Salvatori M et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 2013; 34 (22): 5488–5495. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.03.054.Peloso A, Urbani L, Cravedi P, Katari R, Maghsoudlou P, Fallas MEA et al. The human pancreas as a source of pro-tolerogenic extracellular matrix scaffold for a new generation bio-artificial endocrine pancreas. Ann Surg. 2016; 264 (1): 169–179. doi: 10.1097/SLA.0000000000001364.Peloso A, Urbani L, Cravedi P, Katari R, Maghsoudlou P, Fallas MEA et al. The human pancreas as a source of pro-tolerogenic extracellular matrix scaffold for a new generation bio-artificial endocrine pancreas. Ann Surg. 2016; 264 (1): 169–179. doi: 10.1097/SLA.0000000000001364.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011. 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011. 32 (12): 3233–3243. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057.Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro».Mezhgosudarstvennyj standart GOST ISO 10993-5-2011 «Izdeliya medicinskie. Ocenka biologicheskogo dejstviya medicinskih izdelij. Chast’ 5. Issledovanie na citotoksichnost’: metody in vitro».

The authors declare that there are no conflicts of interest present.