Герасимов Максим Юрьевич. Адрес: 127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59а. Тел. (499) 488-85-58.
Gerasimov Maxim Yurievich. Address: 127486, Beskudnikovsky blvd., 59a, Moscow. Теl. (499) 488-85-58.
Цель. Постановка методики культивирования эксплантов и апробация упрощенной рецептуры культуральных сред для получения устойчивой популяции эпителия слизистой губы человека без фидерных клеток. Материалы и методы. Образцы слизистой губы были получены от 6 пациентов в условиях операционной после подписания информированного добровольного согласия. Экспланты для культивирования выделяли с помощью микрохирургической техники, отделяя подслизистую часть перед слоем эпителия. Культивирование проводили в базовых средах DMEM/F12 (1:1) (1,05 мМ кальция) и EpiLife (0,06 мМ кальция) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотика-антимикотика, инсулина 5 мкг/мл, гидрокортизона 5 мкг/мл и эпидермального фактора роста 10 нг/мл. Клетки нулевого пассажа окрашивали на маркеры стволовости и пролиферации (p63), промежуточных филаментов (виментин) и белка плотных межклеточных контактов тип 1 (ZO-1). Анализ изображений проводили в программе Fiji (ImageJ). Результаты. Первичная культура клеток эпителия слизистой губы была получена от всех доноров в обоих группах. Морфология клеток в культурах соответствовала классическому, по типу «булыжной мостовой». При культивировании в среде с 1,05 мМ кальция определялось 34,7% клеток (медиана, n = 3), экспрессирующих маркер p63, а длина участков экспрессии белка ZO-1 составила 17,05 мкм на клетку по медиане (n = 3). В культуре клеток в среде с 0,06 мМ кальция положительная экспрессия маркера p63 составила 39,2% (медиана, n = 3), а длина участков экспрессии белка ZO-1 была определена как 5,18 мкм на клетку по медиане (n = 3). Заключение. В настоящей работе представлен подробный протокол получения культуры клеток эпителия слизистой губы человека с высокой пролиферативной активностью из малого биоптата без фидерного слоя. Рецептура среды с 1,05 мМ кальция активирует образование плотных межклеточных контактов, и может быть использована при моделирования дифференцировки эпителия in vitro. Рецептура среды с 0,06 мМ кальция, напротив, поддерживает сниженный уровень созревающих клеток в культуре. Таким образом, рецептура культуральных сред, источник и способ культивирования клеток, описанные в данном исследовании, могут являться основой для трансплантации аутологичного клеточного конструкта клеток эпителия слизистой губы у пациентов с двусторонним синдромом лимбальной недостаточности.
Aim: to obtain a stable population of the human labial mucosal epithelium without feeder cells through explant culture technique and simplified formulation of the culture media.
Materials and methods. Labial mucosa samples were obtained from 6 patients in the operating room after the patients had signed an informed consent. Samples were trimmed of the substantia propria and cut into uniformed explants. Cell culture was done using DMEM/F12 (1:1) (1.05 mM calcium) and EpiLife (0.06 mM calcium) media, supplemented with 5% fetal bovine serum, antibioticantimycotic, insulin (5 μg/mL), hydrocortisone (5 μg/mL) and epidermal growth factor (10 ng/mL). Primary cells were stained for stemness and proliferative markers (anti-p63), intermediate filaments (anti-vimentin), and tight junction protein-1 (anti-ZO-1). Image analysis was performed in Fiji (ImageJ).
Results. Primary cell culture was obtained from all the samples in both media. Cellular morphology was characterized as a classic “coble-stone” phenotype. 34.7% p63-expressing cells (median, n = 3) was detected in the 1.05 mM Ca medium, while ZO-1 expression was estimated at 17.05 μm per cell (median, n = 3). In cells cultured in 0.06 mM Ca medium, positive p63 expression was 39.2% (median, n = 3), while the length of the ZO-1 expression was 5.18 μm per cell (median, n = 3).
Conclusion. This study presents a detailed protocol on how to obtain cell culture of human labial mucosal epithelium from a small biopsy with high proliferative activity without feeder cells condition. The 1.05 mM Ca medium promoted generation of the tight junction and may be used in in vitro epithelium differentiation models. In contrast, the 0.06 mM Ca medium maintained reduced level of maturation in the cell culture. Thus, the media formulations, cell culture source and method described in this study, may be used for transplantation of autologous labial mucosal epithelium in patients with bilateral limbal stem cell deficiency.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.