vtioВестник трансплантологии и искусственных органовRussian Journal of Transplantology and Artificial Organs1995-1191Academician V.I.Shumakov National Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs", Ministry of Health of the Russian Federation10.15825/1995-1191-2019-2-84-91vtio-1024Research ArticleРЕГЕНЕРАТИВНАЯ МЕДИЦИНА И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИREGENERATIVE MEDICINE AND CELL TECHNOLOGIESРазработка техники трансплантации 3D-клетонных сфероидов ретинального пигментного эпителия в опыте на животныхThe development of transplantation technique of 3D spheroids retinal pigment epithelium in the experiment on animalsБорзенокС. А.BorzenokS. A.ХаценкоЕ. И.KhatsenkoE. I.

Хаценко Евгений Игоревич

117452, Москва, Балаклавский проспект, 16, кв. 502, Тел. (916) 101-75-72

Khatsenko Evgeny Igorevich

16/502, Balaklavsky avenue, Moscow, 117452, Tel. (916) 101-75-72

e.hacenko@mail.ruОстровскийД. С.OstrovskiyD. S.

Москва

Moscow

ХубецоваМ. Х.KhubetsovaM. K.

Москва

Moscow

ШацкихА. В.ShatskikhA. V.

Москва

Moscow

ТрифаненковаИ. Г.TrifanenkovaI. G.

Калужский филиал, Калуга

The Kaluga Branch, Kaluga

ПлахотнийМ. А.PlakhotnyiM. A.

Калужский филиал, Калуга

The Kaluga Branch, Kaluga

ЕрохинаЕ. В.ErokhinaЕ. V.

Калужский филиал, Калуга

The Kaluga Branch, Kaluga

ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России; ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РоссииРоссияS.N. Fedorov NMRC MNTK «Eye Microsurgery; FSBEI HE «A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry» MOHRussian FederationФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РоссииРоссияS.N. Fedorov NMRC MNTK Eye MicrosurgeryRussian FederationФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России; ФГБНУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологииРоссияS.N. Fedorov NMRC MNTK «Eye Microsurgery; The Institute of General pathology and PathophysiologyRussian FederationФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РоссииРоссияS.N. Fedorov NMRC MNTK «Eye MicrosurgeryRussian FederationФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РоссииРоссияS.N. Fedorov NMRC «MNTK Eye MicrosurgeryRussian Federation2019110720192128491Copyright © Борзенок С.А., Хаценко Е.И., Островский Д.С., Хубецова М.Х., Шацких А.В., Трифаненкова И.Г., Плахотний М.А., Ерохина Е.В., 20192019Борзенок С.А., Хаценко Е.И., Островский Д.С., Хубецова М.Х., Шацких А.В., Трифаненкова И.Г., Плахотний М.А., Ерохина Е.В.Borzenok S.A., Khatsenko E.I., Ostrovskiy D.S., Khubetsova M.K., Shatskikh A.V., Trifanenkova I.G., Plakhotnyi M.A., Erokhina Е.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.transpl.ru/vtio/article/view/1024Цель исследования

Цель исследования. Разработка техники трансплантации SD-клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия (РПЭ) на глазах экспериментальных животных (кролики).

Материалы и методы

Материалы и методы. SD-сфероиды РПЭ для последующей трансплантации создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США). Фенотип полученных клеточных культур исследовали с помощью иммуноцитохимического анализа (лазерный сканирующий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония). Всем экспериментальным животным (кролики породы шиншилла, n = 10) выполняли витрэктомию - 2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт. ст. (Alcon, Accurus, США), ретинотомию и субретинально вводили сфероиды РПЭ (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). Методы послеоперационного контроля: ультразвуковое В-сканирование глаза (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическая когерентная томография - ОКТ (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Германия). Глазные яблоки энуклеировали на 7, 10, 14, 20-е сутки для последующего гистологического исследования.

Результаты

Результаты. Иммуноцитохимическое окрашивание выявило сохранение фенотипа РПЭ в форме 3D-сфе-роидов. В послеоперационном периоде у всех экспериментальных животных по данным ультразвукового В-сканирования и ОКТ отмечалась схожая клиническая картина: отек и плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также, по данным ОКТ, субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм - предположительно 3D-сфероиды РПЭ. По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.

Заключение

Заключение. Предложенная технология культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позволяет сохранить эпителиальный фенотип клеток. Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ является приемлемой и может использоваться для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику.

Aim

Aim. This research is aimed to devise the technique for transplantation of 3D spheroids retinal pigment epithelium (RPE) in the experimental animal’s eyes (rabbits).

Materials and methods

Materials and methods. 3D spheroids of RPE for subsequent transplantation were created using agarose tablets (3D Petri Dishes, Microtissue, USA). The phenotype of the obtained cell cultures was studied by immunocytochemical tests (laser scanning confocal microscope “Fluo View FV10i”, Olympus, Japan). Vitrectomy - 2500 cuts per minute, vacuum 600 mm Hg (Alcon, Accurus, USA) was performed on all rabbits (n = 10). Then, we made retinotomy and injected spheroids in subretinal space (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, USA). The following methods of control: ultrasound B-scan (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Japan) and optical coherence tomography (OCT), (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Germany). Eyes were enucleated for histological examination on 7, 10, 14 and 20 days.

Results

Results. Immunocytochemical tests revealed preservation of the RPE epithelial phenotype in 3D spheroids. Clinical map was similar in all experimental animals - during the first 7 days after surgery we saw cystic edema and flat retinal detachment in the surgery area. As we observed, the retina was adjoining and retinal edema was decreasing. Also, on day 3, 7 and 10 on OCT we saw subretinal round conglomerates with a diameter of 60 to 80 µm - presumably RPE 3D spheroids. According to histological findings, there was observed adhesion of the RPE spheroids to the choroid with subsequent spreading and formation of new cell layer with the increase of observation periods.

Conclusion

Conclusion. The proposed technology of cultivation of rabbit RPE with subsequent construction of 3D spheroids allows to preserve the epithelial phenotype of cells. The developed surgical technique of RPE transplantation is acceptable and can be used for further experimental studies to be implemented in clinical practice.

ретинальный пигментный эпителийSD-сфероидывозрастная макулярная дегенерацияretinal pigment epithelium3D spheroidage-related macular degenerationReferencesБалашова ЛМ.Витаминно-минеральные комплексы и здоровье глаз. Клиническая офтальмология. 2008; 9 (1): 41-45.Balashova LM. Vitaminno-mineral’nye kompleksy i zdorov’e glaz. Klinicheskaya oftal’mologiya. 2008; 9 (1): 41-45.Бикбов ММ, Файзрахманов РР. Оперативное лечение пациентов с фиброваскулярными мембранами при макулярной дегенерации с частичным восстановлением пигментного эпителия сетчатки. Современные технологии в офтальмологии. 2017; 1: 35-38.Bikbov MM, Fajzrahmanov RR. Operativnoe lechenie pacientov s fibrovaskulyarnymi membranami pri makulyarnoj degeneracii s chastichnym vosstanovleniem pig-mentnogo epiteliya setchatki. Sovremennye tekhnologii v oftal’mologii. 2017; 1: 35-38.Борзенок СА, Кошелева АВ, Попов ИА, Сабурина ИН и др. 3D-культивирование ретинального пигментного эпителия трупных донорских глаз человека на предтрансплантационном этапе. VII Всероссийский съезд трансплантологов. Материалы съезда. М., 2014: 262-263.Borzenok SA, Kosheleva AV, Popov IA, Saburina IN i dr. 3D-kul’tivirovanie retinal’nogo pig-mentnogo epiteliya trupnyh donorskih glaz chelove-ka na predtransplantacionnom etape. VII Vserossijskij s»ezd transplantologov. Materialy s»ezda. M., 2014: 262-263.Либман ЕС, Шахова ЕВ. Слепота, слабовидение и инвалидность по зрению в Российской Федерации. Российский межрегиональный симпозиум «Ликвидация устранимой слепоты: Всемирная инициатива ВОЗ»: Материалы. М., 2003: 38-42.Libman ЕS, Shahova Е1. Slepota, slabovidenie i invalidnost’ po zre-niyu v Rossijskoj Federacii. Rossijskij mezhregional’nyj simpozium «Likvidaciya ustranimoj slepoty: Vsemirnaya iniciativa VOZ»: Materialy. M., 2003: 38-42.Algvere PV Berglin L, Gouras P, Sheng Y, Kopp ED. Transplantation of RPE in age-related macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1997; 235 (3): 149-158.Algvere PV Berglin L, Gouras P, Sheng Y, Kopp ED. Transplantation of RPE in agtrelated macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1997; 235 (3): 149-158.Binder S, Krebs I, Hilgers RD, Abri A, Stolba U, Assa-doulina A et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45 (11): 4151-4160.Binder S, Krebs I, Hilgers RD, Abri A, Stolba U, Assa-doulina A et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45 (11): 4151-4160.Binder S, Stolba U, Krebs I, Kellner L, Jahn C, Feichtin-ger H et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 2002; 133 (2): 215-225.Binder S, Stolba U, Krebs I, Kellner L, Jahn C, Feichtinger H et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 2002; 133 (2): 215-225.Bindewald A, Roth F, Van Meurs J, Holz FG. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004; 101 (9): 886-894.Bindewald A, Roth F, Van Meurs J, Holz FG. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004; 101 (9): 886-894.Caramoy A, Liakopoulos S, Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011; 89 (8): 666-668.Caramoy A, Liakopoulos S, Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011; 89 (8): 666-668.Falkner-Radler CI, Krebs I, Glittenberg K et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011; 95: 370-375.Falkner-Radler CI, Krebs I, Glittenberg K et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011; 95: 370-375.Cuiping Zhao, Nathan C. Boles, Justine D. Miller, Suzanne Kawola, Sally Temple, Richard J. Davis, Jeffrey H. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. Journal of Visualized Experiments. (126), e55220.Cuiping Zhao, Nathan C. Boles, Justine D. Miller, Suzanne Kawola, Sally Temple, Richard J. Davis, Jeffrey H. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. Journal of Visualized Experiments. (126), e55220.Del Priore LV, Kaplan HJ, Tezel TH, Hayashi N, Berger AS, Green WR. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am J Ophthalmol. 2001; 131 (4): 472-480.Del Priore LV, Kaplan HJ, Tezel TH, Hayashi N, Berger AS, Green WR. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am J Ophthalmol. 2001; 131 (4): 472-480.Eyetech Study Group. Antivascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003; 110 (5): 979-986.Eyetech Study Group. Antivascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to agerelated macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003; 110 (5): 979-986.van Meurs JC, Eter Averst, Hofland LJ, van Hagen PM, Mooy CM, Baarsma GS et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br J Ophthalmol. 2004; 88: 110-113.van Meurs JC, Eter Averst, Hofland LJ, van Hagen PM, Mooy CM, Baarsma GS et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br J Ophthalmol. 2004; 88: 110-113.Nita M, Strzaika-Mrozik B, Grzybowski A, Romaniuk W, Mazurek U. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. Med Sci Monit. 2012; 18 (6): RA97-103.Nita M, Strzaika-Mrozik B, Grzybowski A, Romaniuk W, Mazurek U. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. Med Sci Monit. 2012; 18 (6): RA97-103.Schmidt-Erfurth U, Hasan T, Gragoudas E, Michaud N, Flotte TJ, Birngruber R. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994; 101 (12): 1953-1961.Schmidt-Erfurth U, Hasan T, Gragoudas E, Michaud N, Flotte TJ, Birngruber R. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994; 101 (12): 1953-1961.Yannuzzi LA, Friedman R, Fine SL, Gass JD, Gitter KA, Orth DH, Singerman LJ. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988; 64 (9): 955-1013.Yannuzzi LA, Friedman R, Fine SL, Gass JD, Gitter KA, Orth DH, Singerman LJ. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988; 64 (9): 955-1013.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.